Hydra Vulgaris 2.0:Creatura Vivente Immortale che si nutre di GRAFENE nelle iniezioni di covid-Xenobot? Micro-nano cubi Palesi MEMS (Micro Electro Mechanical System -ergo Smart Dust)

Brevetto con HYDRA VULGARIS TRANSGENICA
https://patents.google.com/patent/WO200901...=hydra+vulgaris
Monitoraggio dell'effetto biologico mediante idra transgenica
Astratto
L'invenzione riguarda l'idra transgenica che, in presenza di almeno un fattore di stress nel mezzo che la circonda, esprime almeno un gene reporter inducibile dal fattore di stress; all'uso di questa idra transgenica come sistema di biomonitoraggio e ad un metodo per rilevare i fattori di stress nei campioni mediante l'idra transgenica. Inoltre, sono descritte cassette di espressione che, previa integrazione in opportuni vettori, possono essere sfruttate per generare idra transgeniche impiegabili come biomonitor.

CLASSIFICAZIONE : A01K67/0333 Invertebrati geneticamente modificati, ad es. transgenici, poliploidi

9. Uso dell'idra transgenica secondo le rivendicazioni da 1 a 8 come biomonitor per
Rilevazione di sostanze tossiche e/o germi microbici.
10. Un metodo per rilevare almeno un fattore di stress in un campione, caratterizzato dal contatto del campione con idra transgeniche, in cui questi nel
Presenza dell'almeno un fattore di stress che esprime un gene reporter inducibile dal rispettivo fattore di stress, nonché la rilevazione del rispettivo prodotto del gene reporter mediante irradiazione dell'Hydra transgenica con luce di una lunghezza d'onda di eccitazione adeguata e l'esame della luce emessa quindi dal prodotto del gene reporter.
11. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che sia lo stressor sia una sostanza tossica.
12. Metodo secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che le idra transgeniche sono prodotte per trasfezione con un vettore contenente la cassetta di espressione secondo SEQ ID: NO 3. 13. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che è lo stress fattore di germi microbici.
14. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che i germi microbici sono scelti dal gruppo costituito da batteri, funghi e virus.
15. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che le idra transgeniche sono prodotte per trasfezione con un vettore contenente la cassetta di espressione secondo SEQ ID: NO 4.
16. Metodo secondo le rivendicazioni 11 e 14, caratterizzato dal fatto che l'idra transgenica esprime un primo gene reporter in presenza di un primo fattore di stress e in presenza di un secondo fattore di stress, un secondo del primo gene reporter distinguibile.
17. Metodo secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che le idra transgeniche sono prodotte per trasfezione con un vettore contenente la cassetta di espressione secondo SEQ ID: NO 5.
18. Cassetta di espressione, caratterizzata da una sequenza nucleotidica che è scelta dal gruppo costituito dalle sequenze nucleotidiche fornite in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5.
19. Uso di un vettore contenente una cassetta di espressione secondo la rivendicazione 18 per la produzione di idra transgenica utilizzabile come sistema di biomonitoraggio.


Descrizione
Monitoraggio dell'effetto biologico di Hydra . transgenico
L'invenzione riguarda biomonitor, in particolare per il controllo dell'acqua potabile e della qualità dell'acqua, idra transgenica utilizzabile, integrabile in comuni cassette di espressione di vettori per la loro produzione e un metodo per la rilevazione di inquinanti mediante idra transgenica.
Il volume sempre crescente di rifiuti chimici e microbici provenienti da attività industriali e altre attività umane richiede urgentemente lo sviluppo di sistemi di allarme rapido basati su biomonitor. Le istituzioni scientifiche stanno aumentando da anni la richiesta di monitoraggio degli effetti biologici, con cui è possibile dimostrare gli effetti delle tossine ambientali e dei germi microbici sugli organismi.

Negli habitat acquatici, oltre all'eutrofizzazione, le tossine ambientali e i germi microbici svolgono un ruolo crescente nella distribuzione e diversità delle specie e nella loro capacità di sopravvivere e riprodursi. La miscela di tossine ambientali e germi microbici nelle nostre acque è ingestibile e diversificata. L'analisi chimica mirata delle singole sostanze può catturare solo una piccola parte di questa miscela. Decisivo per la sopravvivenza degli animali che vivono lì è l'interazione di tutte le singole sostanze esistenti e molti altri fattori. Pertanto, è necessario trovare metodi di rilevamento che diano una "risposta" biologica alla miscela di tossine ambientali e germi microbici al fine di rilevare in anticipo potenziali pericoli. veleno, fioritura microbica) ed effetto (effetto biologico) è breve, e quindi si riceve una risposta rapida e anche sensibile.
Nell'ambito dei programmi di monitoraggio delle acque, gli inquinanti vengono attualmente misurati nei sedimenti e nell'acqua. Le valutazioni sono effettuate sulla base di valori limite fisico-chimici e/o microbiologici. Tuttavia, esistono anche metodi che possono essere utilizzati per dimostrare una "risposta" biologica alla presenza di tossine ambientali e agenti patogeni negli habitat acquatici, utilizzando organismi microbici, animali o vegetali e denominati "bioindicatori" o "biomimetici". che rispondono alla presenza di tossine ambientali (es. sostanze chimiche, metalli pesanti) e/o altri fattori di stress (es. calore, mancanza di ossigeno, ecc.), essenzialmente alterando le funzioni vitali (es. frequenza respiratoria, mobilità, luminescenza esempio, l'uso del pesce in un canale di prova attraverso il quale scorre l'acqua da testare è descritto in DD 238 113 A. In caso di danneggiamento, i pesci vengono spinti contro una griglia, quest'ultima essendo in gran parte bloccata, riducendo così l'acqua livello Questo genera un allarme in presenza di costituenti dell'acqua dannosi per i pesci.
DE 698 25 873 T2 descrive un metodo per il monitoraggio biologico automatico della qualità dell'acqua valutando il comportamento respiratorio e il movimento del corpo del pesce utilizzato in questo caso.
In DE 44 40 320, il comportamento chemiosensoriale negativo dei ciliati unicellulari è registrato come misura del carico chimico dei campioni ambientali.
In US 6.340.572 Bl l'uso di u. un. batteri luminescenti, funghi, estratti di pesce e dinoflagellati utilizzati per rilevare le sostanze tossiche in un campione perturbato in presenza di sostanze tossiche, la luminescenza degli organismi di prova e la diminuzione dell'emissione di luce viene rilevata contro un controllo.

Il polipo d'acqua dolce Hydra è un sistema di test tossicologici di lunga data. Quindi Z. B. le elevate capacità rigenerative di questo multicellulare basale nella produzione di "embrioni artificiali" da aggregati cellulari utilizzati, che possono essere utilizzati in particolare per la rilevazione di effetti tossicologici teratogeni (teratogeni) di sostanze chimiche, come descritto, ad esempio, negli Stati Uniti 4.346.070 è anche l'uso di Hydra come biomonitor nell'acqua potabile, nelle acque reflue e nel monitoraggio dell'acqua z Arkhipchuk et al. Ambiente inquinato, 2006 luglio; 142 (2): 200-11), Pardos et al. ("Valutazione della tossicità acuta dell'acqua lucida (rifiuto) con un saggio di idra attenuata basato su micropiastra: un confronto con il test Microtox. "Vedi Total Environ., 1999 Dec 15; 243-244: 141-8) e da Fu et al. ("Applicazione del saggio Hydra attenuata per identificare i rischi di sviluppo tra acque naturali e acque reflue." Ecotoxicol Environ Saf. 1991 Dec; 22 (3): 309-19).
US Pat. 5.877.398 descrive l'uso di nematodi transgenici che, in presenza di sostanze tossiche in un campione ambientale a contatto con esse, reagiscono con l'espressione di un gene reporter rilevabile istochimicamente.
Il modello di topo transgenico descritto in WO 99/11772 si basa su un principio simile. In presenza di sostanze tossiche, i topi transgenici o le colture cellulari da essi derivate esprimono un gene reporter rilevabile con test di laboratorio (un ormone umano).
Lo stato dell'arte attualmente esistente presenta diversi inconvenienti. Gli attuali limiti all'utilizzo dei biomonitor derivano, tra l'altro, da una scarsa conoscenza della ricerca di base e applicata, dalla scarsa pronunciabilità ai vari livelli dell'organizzazione biologica (cellula, tessuto, organismo), nonché dalla spesso impraticabile applicabilità nella pratica. Quindi Z. B. Sistemi di biomonitoraggio che si basano sull'analisi della frequenza respiratoria e dei movimenti corporei dei pesci, non sufficientemente sensibili e quindi in grado di rilevare solo concentrazioni tossiche acute di inquinanti. Gli effetti dannosi a lungo termine (danni al feto, danni al genoma, cancro) e le concentrazioni di inquinanti che portano a sintomi rilevabili solo dopo diversi giorni o settimane non sono prontamente registrati da questi sistemi di biomonitoraggio. L'uso nel monitoraggio online, z. Come nella produzione di acqua potabile, questo non è praticabile.

Anche i sistemi di monitoraggio ormai disponibili in commercio, basati sull'uso di organismi luminescenti (es. Microtox assay) funzionano solo a concentrazioni relativamente elevate di inquinanti o sostanze altamente tossiche, associate a una significativa perdita di vitalità e quindi di luminescenza tra gli organismi in esame. I modelli animali di mammiferi transgenici, come il già citato modello murino, o le colture cellulari primarie da esso derivate, non sono adatti per il monitoraggio in linea continuo di z. B. acqua potabile. Inoltre, sono necessarie analisi di laboratorio relativamente complesse, possibilmente strutture per colture cellulari e personale qualificato. Inoltre, la produzione o l'approvvigionamento dei topi transgenici o la coltivazione delle corrispondenti colture cellulari è molto costosa. Caenorhabditis elegans transgenico, che, come descritto nel brevetto statunitense n. 5.877.398, esprimono geni reporter quando sono presenti inquinanti, sono anche poco adatti per il monitoraggio continuo della qualità dell'acqua potabile e dell'acqua corporea o per rilevare tracce di contaminanti specifici dell'acqua, poiché C. elegans non è un organismo acquatico, ma un habitat -abitante del suolo classico straniero. Il contatto continuo dell'organismo di prova con l'acqua da monitorare (vantaggiosamente, l'organismo di prova dovrebbe essere completamente lambito da essa) dovrebbe essere impossibile nell'uso di C. elegans transgenici, poiché annegherebbero immediatamente. Il polipo d'acqua dolce Hydra, invece, è un classico organismo d'acqua dolce ed è molto sensibile anche alle più piccole tracce di impurità ed è quindi spesso superiore al diffusissimo test Microtox in termini di sensibilità (Pardos et al., lucidare l'acqua (di scarico) con un saggio Hydra attenuata basato su micropiastra: un confronto con il test Microtox "Be Total Environ., 1999 Dec 15; 243-244: 141-8), ma finora non è lo stato dell'arte utilizzando Hydra o uno qualsiasi degli altri È quindi possibile differenziare tra loro i singoli fattori di stress (inquinanti, germi e altri fattori ambientali dannosi) che agiscono sul rispettivo biomonitor, e vi è quindi la necessità di sistemi di biomonitoraggio adatti a questo scopo.
Lo scopo della presente invenzione è quindi quello di fornire un sistema di biomonitoraggio praticabile, sensibile ed economico per l'acqua potabile e il monitoraggio dell'acqua, che fornisca informazioni immediate sul tipo di fattore di stress rilevato. Lo scopo viene raggiunto fornendo un'idra transgenica avente le caratteristiche elencate nella rivendicazione 1. Le sottorivendicazioni indicano forme di realizzazione vantaggiose dell'invenzione.

L'idra è un organismo comune che si trova in tutti gli habitat acquatici. I polipi vivono in tutte le acque dolci e reagiscono molto rapidamente a un deterioramento della qualità dell'acqua (inquinamento da metalli pesanti, ecc.) o della temperatura dell'acqua con una risposta allo stress (Bosch et al., Termotolleranza e sintesi di proteine ​​da shock termico: Hydra attenuata ma assente in Hydra oligactis. "Proc Natl Acad Sci USA, 1988 Nov; 85 (21): 7927-31).
Gli inventori hanno scoperto geni in Hydra che sono specificamente regolati da diversi segnali ambientali (fattori di stress) come temperatura, presenza di sostanze tossiche e germi microbici. Questi sono il gene Hydra hsp70.1 (Accesso No. M84019, SEQ ID NO: 1) e pericolina (SEQ ID NO: 2).
hsp70.1 codifica per l'Hydra Heat Shock Protein (HSP) 70. Questo gene è molto sensibile alle variazioni di temperatura nell'acqua che circonda l'idrato (Gellner et al., "Cloning and expression of an inducible hsp70 gene in two species oihydra which Differ in loro risposta allo stress "Eur J Biochem 1992, 210, 683-691.) Inoltre, tracce di sostanze tossiche (ad es. sodio azide, metalli pesanti) nell'acqua portano ad un aumento significativo della trascrizione del gene hsp70.1, con conseguente la corrispondente regione 5'-regolatrice (promotore) di questo gene è particolarmente adatta alla regolazione sensibile e specifica di un gene reporter per la rilevazione di sostanze tossiche.
Al contrario, la trascrizione del gene idra periculina è specificamente indotta da contaminanti microbici dell'acqua come batteri, funghi e virus o da sostanze caratteristiche per loro, ad esempio lipopolisaccaridi (LPS) da batteri gram-negativi o RNA virale a doppio filamento. Il corrispondente promotore di periculina può quindi essere utilizzato come regolatore molto sensibile e specifico per la trascrizione di un gene reporter indicativo di contaminazione microbica. I rispettivi promotori di questi geni potrebbero essere identificati e integrati in diversi costrutti di DNA (cassette di espressione). Secondo l'invenzione, questi sono affiancati da siti di restrizione Nelt e possono essere facilmente integrati in un vettore dorsale adatto al clonaggio e alla propagazione nel batterio Escherichia coli. Ogni cassetta di espressione contiene endonucleasi di restrizione uniche per le endonucleasi di restrizione ApaLI, XbaI, BamHI, Sbfl, Pacl, AsiSI, AscI e Fsel. Queste interfacce consentono una facile sostituzione e combinazione di diversi promotori e geni reporter. Le cassette di espressione contengono ciascuna almeno uno dei promotori di stress sopra descritti e il rispettivo gene reporter regolato da esso (ad esempio GFP, eGFP, YFP, eYFP, CFP, dsRED, BFP, mTFPl, Emerald, Citrine, mOrange, mApple, mCherry , mGrape ).

Il gene reporter è seguito da una sequenza di terminazione dell'espressione, preferibilmente il terminatore di idra actina. Inoltre, la cassetta di espressione può contenere un altro gene reporter rilevabile con luce fluorescente, che è sotto il controllo di un forte promotore costitutivo. Questo può essere z. Esempio, il promotore del gene dell'actina di Hydra, come mostrato in Fig. 2. Questo gene reporter aggiuntivo costitutivamente esprimibile nel gene reporter di Hydra può opzionalmente dopo microiniezione dei vettori di espressione in embrioni di idra precoci, come in Wittlieb et al. ("L'idra transgenica consente il monitoraggio in vivo di singole cellule staminali durante la morfogenesi." Proc Natl Acad US Pat. No. 2006 Apr 18; 103 (16): 6208-11), il controllo dell'efficienza della trasfezione e la selezione di trasfettati con successo Pertanto, ad esempio, possono essere generate varie linee Hydra transgeniche, ognuna delle quali è adatta per indicare la presenza di un fattore di stress specifico tramite l'espressione inducibile dallo stress di un gene reporter adatto e il suo, ad esempio, prodotto genico rilevabile con fluorescenza 4 e 6 ), solo un gene reporter inducibile da stress per cassetta di espressione è mostrato a titolo di esempio in ciascuna delle Figure 1 e 2. Tuttavia, è altrettanto possibile integrare due diversi geni reporter inducibili da stress nella cassetta di espressione In questo caso, geni reporter selezionati i cui prodotti genici sotto il colore della luce fluorescente possono essere chiaramente distinti l'uno dall'altro kö Ad esempio, GFP e dsRED. L'idra transgenica preparata per mezzo di questi costrutti di geni reporter multi-inducibili viene incubata sotto luce fluorescente a contatto con metalli pesanti, ad es. B. verde e in presenza di batteri z. B. bagliore rosso. Ciò consente di distinguere tra diversi fattori di stress ambientale con la stessa linea idra transgenica. Nei costrutti di geni reporter inducibili in modo multiplo, può essere vantaggioso fare a meno dei geni reporter espressi costitutivamente aggiuntivi che servono a controllare il successo della trasfezione al fine di evitare interazioni negative con i geni reporter inducibili. In questo caso Z. B. viene utilizzato uno dei geni reporter inducibili per incubazione a breve termine con il rispettivo fattore di stress per controllare il successo della trasfezione e per la selezione degli animali trasfettati. Le sequenze di acido nucleico delle diverse cassette di espressione secondo l'invenzione sono mostrate sotto SEQ ID: N0 3-5.

Utilizzando le idra-line transgeniche così preparate come biomonitor, è possibile, ad esempio, realizzare sistemi automatici in cui le idra transgeniche vengono continuamente immerse nell'acqua da monitorare. Le corrispondenti idra culture vengono irradiate o permanentemente, ma preferibilmente per evitare un prematuro sbiancamento della fluorescenza, a brevi intervalli con luce fluorescente di opportuna lunghezza d'onda di eccitazione. Questo può essere z. B. con l'ausilio di un microscopio a fluorescenza modificato o preferibilmente un Auflichtbinokulars fluorescenza fatto. Utilizzando una telecamera adatta, la coltura viene analizzata per l'espressione dei rispettivi geni reporter ad ogni intervallo di irradiazione. Se uno dei rispettivi prodotti del gene reporter è rilevabile, viene generato un segnale di avviso tramite un software di analisi appropriato e / o vengono attivati ​​​​protocolli di sicurezza appropriati (ad es. chiusura dell'approvvigionamento idrico). Naturalmente, le idra transgeniche secondo l'invenzione sono adatte anche per l'analisi mirata di campioni di acqua prelevati da acqua dolce. Qui, le colture di idra vengono incubate per un certo tempo con i rispettivi campioni d'acqua e controllate ad intervalli regolari, come descritto sopra, per l'espressione dei rispettivi prodotti del gene reporter. Per analogia con ciò, è ovvio che sostanze che possono anche essere disciolte in acqua e devono essere testate per la tossicità possono essere testate per il loro effetto biologico con l'idra transgenica secondo l'invenzione.

L'utilizzo di idra transgeniche, che esprimono un particolare gene reporter nel mezzo circostante quando è presente un determinato fattore di stress, consente quindi il monitoraggio pratico, sensibile ed economico della qualità dell'acqua potabile e dei corpi idrici. Inoltre, l'uso dell'Hydra transgenica consente anche affermazioni su cambiamenti funzionali e strutturali a livello di cellule e tessuti. Questi includono la rilevazione di stress ossidativo, alterazioni tissutali patologiche, inibizione enzimatica, disfunzioni della differenziazione cellulare, effetti genotossici e molto altro.