BANCA DATI: FAGO M13 - Collegato a Morgellons - I computer superveloci del futuro funzioneranno grazie a un virus biologico

https://patents.google.com/patent/US20070232790?oq=fago+m13
Produzione di anticorpi anti-auto da repertori di segmenti di anticorpi e visualizzati sul fago
US200702322790A1
stati Uniti
Applicazione US11/625.769 eventi
1991-12-02
Priorità a GB919125579A
1999-08-10
Primo contenzioso familiare in tutto il mondo archiviato
2007-01-22
Domanda presentata dal Medical Research Council, Cambridge Antibody Technology Ltd
04-10-2007
Pubblicazione di US20070232790A1
Stato
Abbandonato

CI sono svariati FAGO ,vedere qui da brevetto. MrNA incluso e si parla di ospiti inoltre (Morgellons,si ricollega anche la questione dei cicli)

Astratto
Sono descritti metodi per la produzione di anticorpi anti-auto e frammenti di anticorpi, che sono anticorpi o frammenti di una particolare specie di mammifero che legano antigeni auto di quella specie. I metodi comprendono la fornitura di una libreria di pacchetti di visualizzazione genetica replicabili (rgdps), come il fago filamentoso, ogni rgdp che mostra sulla sua superficie un membro di una specifica coppia di legame che è un anticorpo o un frammento di anticorpo e ogni rgdp contenente una sequenza di acido nucleico derivata da una specie di mammifero. La sequenza di acido nucleico in ciascun rgdp codifica una catena polipeptidica che è una parte componente del membro sbp visualizzato sulla superficie di tale rgdp. I frammenti di anticorpo anti-self vengono selezionati legandosi con un antigene self di dette specie di mammifero. I frammenti anticorpali visualizzati possono essere scFv, Fd, Fab o qualsiasi altro frammento che ha la capacità di legare l'antigene. Le librerie di acidi nucleici utilizzate possono essere derivate da sequenze del gene V riarrangiate di mammiferi non immunizzati. Le biblioteche sintetiche o artificiali sono descritte e si sono dimostrate utili.

Descrizione
[0001]
Questa è una continuazione della domanda statunitense co-pendente Ser. 10/326.495 depositato il 19 dicembre 2002 (consentito) che è una continuazione della domanda statunitense Ser. 09/197.224, depositato il 20 novembre 1998, ora brevetto statunitense n. 6.521.404, che è una continuazione della domanda statunitense n. 08/244.597, depositato il 2 dicembre 1992, ora brevetto statunitense n. 5.885.793, che a sua volta è una fase nazionale statunitense di PCT/GB92/02240, depositata il 2 dicembre 1992, che rivendica la priorità a GB 9125579.4 depositata il 2 dicembre 1991, GB 9125582.8 depositata il 2 dicembre 1991, GB 9206318.9 depositata il 24 marzo 1992, GB 9206372.6 depositata il 24 marzo 1992 e PCT/GB92/01755 depositata il 23 settembre 1992. Ciascuna delle precedenti domande è qui incorporata per riferimento.
[0002]
La presente invenzione riguarda l'isolamento di molecole anticorpali dirette contro antigeni self, ad esempio anticorpi umani diretti contro antigeni self umani. La tecnologia di visualizzazione dei fagi per la selezione di molecole anticorpali è stata descritta in WO92/01047, PCT/GB92/00883, PCT/GB92/01755 e GB9206372.6. I richiedenti si sono resi conto che gli anticorpi diretti contro antigeni self possono essere isolati utilizzando la tecnologia del phage display.
[0003]
Gli autoanticorpi umani sono di particolare valore per scopi terapeutici e diagnostici in vivo, poiché evitano i problemi derivanti dall'antigenicità di anticorpi estranei, ad esempio anticorpi di topo. Gli anticorpi umani più utili per la terapia sono quelli diretti contro molecole di superficie cellulare, come recettori, adesine e integrine, e quelli diretti contro molecole effettrici biologiche circolanti, come ormoni, fattori di crescita e citochine. È stato estremamente difficile ottenere anticorpi umani contro tali antigeni self. Questa invenzione fornisce un modo potente per ottenere tali anticorpi.
[0004]
È un compito impegnativo isolare un frammento di anticorpo con specificità contro l'antigene self. Gli animali normalmente non producono anticorpi contro antigeni self, un fenomeno chiamato tolleranza (GJ Nossal Science 245 147-153, 1989). Le malattie autoimmuni possono derivare da una rottura della tolleranza. In generale, la vaccinazione con un autoantigene non determina la produzione di anticorpi circolanti. È quindi difficile aumentare gli anticorpi contro gli antigeni self, in particolare negli esseri umani. È possibile aumentare gli anticorpi che riconoscono gli antigeni umani in un animale come un topo, specialmente se l'antigene umano non è troppo strettamente correlato a nessun equivalente nell'animale. Se è quindi necessario un anticorpo umano, è necessario "umanizzare" l'anticorpo, ad esempio mediante innesto di CDR (brevetto GB2188638B).
[0005]
La tecnologia degli anticorpi fagici come descritta in (WO92/01047) offre la capacità di isolare tali anticorpi umani direttamente in questa applicazione, dimostriamo per la prima volta che gli anticorpi contro gli auto-antigeni possono essere isolati da librerie fagiche derivate, ad esempio, da fonti non immunizzate e da librerie preparate mediante ricombinazione sintetica di sequenze del gene V, preferibilmente ricombinazione di VH con, DH e JH, e VL con sequenze JL. Questi anticorpi sono specifici per il loro antigene. Questa applicazione mostra che le singole librerie derivate in questo modo possono fungere da fonte di antigeni sia estranei che autonomi e apre la prospettiva di una grande libreria universale per isolare gli anticorpi contro qualsiasi antigene.
[0006]
È stato descritto nella domanda di brevetto WO92/01047 che frammenti di anticorpo possono essere visualizzati sulla superficie del batteriofago e che si legheranno all'antigene. I frammenti di anticorpi possono essere selezionati direttamente utilizzando questa caratteristica. Questa capacità di isolare frammenti di anticorpi (Fab, Fv, scFv e VH) utilizzando la loro visualizzazione sulla superficie del batteriofago filamentoso ha aperto la prospettiva dell'isolamento di specificità anticorpali (cioè anticorpi diretti contro un particolare antigene) che erano difficili o impossibili isolare in precedenza. In particolare WO92/01047 dimostra che le specificità anticorpali possono essere isolate da un essere umano che non è stato specificamente immunizzato ("non immunizzato"), anche specificità per antigeni come il 2-fenil-5-ossazolone a cui gli esseri umani non saranno normalmente esposti.
[0007]
Nelle forme di realizzazione di questa invenzione, i repertori di anticorpi naturali o sintetici derivati ​​da una specie di mammifero, come uomo, topo, ratto, pecora, maiale, capra, cavallo o altro, vengono visualizzati sulla superficie di un pacchetto di visualizzazione genetica replicabile (rgdp) e la specificità di legame per self è selezionata legandosi all'antigene self. In questo processo, i repertori di geni V sono derivati ​​da geni V riarrangiati in vitro o in vivo e/o per mutazione di (a) geni V riarrangiati. Una caratteristica chiave dei repertori del gene V è che sono estremamente diversi nella sequenza, solitamente superiori a 10 6membri diversi. In effetti è possibile che una libreria sufficientemente ampia possa fornire una fonte di specificità dirette contro qualsiasi antigene self. I repertori del gene V sono clonati nel rgdp (ad esempio un vettore fago filamentoso) in modo tale che i repertori anticorpali siano visualizzati sulla superficie del rgdp. I rgdps che codificano le rare specificità anticorpali che si legano all'antisé, possono essere selezionati in virtù del legame all'antigene self. I repertori anticorpali possono essere clonati in un formato di replicone singolo o doppio come descritto in W092/01047 e PCT/GB92/00883.
[0008]
I geni V possono essere clonati nel materiale genetico del rgdp, ed espressi come singoli domini, ad esempio domini variabili a catena pesante singola, i cosiddetti ligandi a dominio singolo o "dAbs" (vedi WO90/01544), o come anticorpi associati pesanti e domini variabili della catena leggera.
[0009]
I due domini potrebbero essere visualizzati come catene polipeptidiche separate (legate come nei frammenti Fab attraverso un'associazione non covalente di domini e/o legami disolfuro), o come parte della stessa catena (frammenti Fv a catena singola in cui i due domini sono contenuti all'interno del stessa catena polipeptidica).
[0010]
In W092/01047 e negli esempi da 1 a 8 di questa domanda abbiamo usato la fusione di frammenti di anticorpo con la proteina del gene 3 di batteriofago filamentoso per la visualizzazione e la selezione di frammenti di anticorpo. Un approccio alternativo sarebbe quello di fondere frammenti di anticorpi alla proteina del gene 8 o ad altre molecole di superficie del batteriofago filamentoso.
[0011]
L'isolamento di anticorpi umani diretti contro antigeni umani è un compito impegnativo. Esiste solo un numero limitato di antigeni umani contro i quali si trovano naturalmente anticorpi umani circolanti. Sono presenti anticorpi diretti contro antigeni non self di origine umana. Anticorpi diretti contro il gruppo sanguigno umano B sono stati isolati da una libreria di visualizzazione fagica preparata da soggetti del gruppo sanguigno O (JD Marks et al, J. Mol. Biol. 222 581-597, 1991), che riconoscono l'antigene del gruppo sanguigno B come straniera.
[0012]
La presente invenzione riguarda un metodo generale per l'isolamento di anticorpi diretti contro antigeni self che sono specifici per l'antigene in questione. Molti pazienti mostrano concentrazioni significative di autoanticorpi circolanti. Si stima che dal 10 al 30% dei linfociti B in individui normali e sani siano coinvolti nella produzione di autoanticorpi (IR Cohen e A. Cooke Immunol. Today 7 363-364, 1986). Tuttavia, gli 'autoanticorpi naturali' prodotti non si prestano all'uso terapeutico in quanto sono spesso IgM, a bassa affinità e polireattivi (P. Casali e AL Notkins Ann. Rev. Immunol. 7 515-531, 1989; S. Avrameas Immunol. Oggi 12 154-159). Una risposta immunitaria contro il sé può insorgere in una malattia autoimmune o dopo infezioni e alcuni anticorpi monoclonali diretti contro antigeni del sé sono stati isolati da pazienti con malattia autoimmune (K. James & GT Bell J. Immunol. Methods 100 5-40, 1987). Questi autoanticorpi sono spesso specifici, ma possono legarsi solo a una gamma limitata di epitopi sull'antigene (M. Bouanani et al. Arthritis Rheum. 34 1585-1593, 1991).
[0013]
La preparazione di librerie geniche V derivate dall'mRNA di plasmacellule che secernono anticorpi IgG (o IgM) può quindi portare all'isolamento di frammenti anticorpali derivati ​​da autoanticorpi. Ad esempio, gli anticorpi anti-auto potrebbero essere isolati da pazienti con malattie autoimmuni, ad esempio gli anticorpi anti-recettore dell'acetilcolina dovrebbero essere isolati da repertori di anticorpi prodotti dall'mRNA di IgG di pazienti con miastenia grave. Ad esempio, un frammento di anticorpo specifico per la perossidasi tiroidea umana è stato isolato da una libreria di batteriofagi lambda da un paziente con malattia autoimmune della tiroide (S. Portolano et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 372-377, 1991). Ciò tuttavia ha richiesto un ampio screening di 200.000 placche per ottenere un clone. Inoltre, questa libreria è stata derivata da tessuto tiroideo,
[0014]
Al contrario, il potere di selezione disponibile utilizzando il sistema fagico, dimostrato in WO92/01047, consente il pronto isolamento di autoanticorpi dall'mRNA di IgM dei linfociti del sangue periferico di un donatore senza malattia. Mostriamo nell'esempio 2 che gli anticorpi che si legano alla tireoglobulina umana (che possono essere trovati nei sieri di persone con o senza malattia autoimmune sintomatica), possono essere isolati da repertori di fagi preparati da esseri umani non immunizzati. Non ci si aspetterebbe necessariamente di essere in grado di ottenere anticorpi contro la tireoglobulina umana immunizzando un essere umano con la tireoglobulina umana, nonostante la presenza di autoanticorpi per la tireoglobulina in molte persone. È stato spesso riportato che gli autoanticorpi contro la tireoglobulina nei sieri normali hanno un alto grado di polireattività (S. Avrameas, 1991 supra). In contrasto,
[0015]
In questa applicazione, dimostriamo anche che anche gli anticorpi contro il fattore di necrosi tumorale umano-a possono essere isolati come descritto nell'esempio 1 dalla stessa libreria degli anticorpi diretti contro la tireoglobulina. Molti antigeni self non hanno autoanticorpi circolanti associati rilevabili. Inoltre, l'esempio 3 mostra l'isolamento di anticorpi contro gli antigeni self mucina, antigene carcinoembrionario (CEA) e CD4, anticorpi per i quali non sono stati riportati nei sieri normali. Inoltre, questi anticorpi sono specifici, mentre spesso si riscontra un alto grado di polireattività negli autoanticorpi naturali che a volte si possono riscontrare. La stragrande maggioranza degli autoantigeni non ha autoanticorpi circolanti associati rilevabili.
[0016]
L'origine dei geni V che contribuiscono agli anticorpi anti-auto isolati dalle librerie di visualizzazione dei fagi non è chiara. La tolleranza agli antigeni self da parte del sistema immunitario (impedendo la generazione di anticorpi diretti contro di essi) è mediata dalla delezione clonale o dall'inattivazione funzionale (anergy) dei linfociti B autoreattivi (DA Nemazee & K. Burki Nature 337 562-566, 1989 ; CC Goodnow et al Nature 334 676-682, 1988; SB Hartley et al Nature 353 765-769, 1991; DM Russell et al Nature 354 308-311, 1991). In entrambi i casi, per la maggior parte degli antigeni è rilevabile una piccola quantità di anticorpi anti-self circolanti. Tuttavia, in caso di anergia, le cellule autoreattive funzionalmente inattivate della linea cellulare B persistono negli organi linfoidi periferici che portano alle cellule B in circolazione. Questi rari linfociti con specificità anti-self possono fornire partner di catene pesanti o leggere (o anche entrambi) per anticorpi fagici con specificità anti-self. In alternativa, tali specificità anti-sé possono derivare dalla combinazione nella libreria di un dominio VH con un dominio VL per dare una specificità che normalmente viene cancellata se si verifica in natura. Per questo motivo, le librerie combinatorie e le librerie "chain-shuffled" come descritte nelle domande di brevetto WO92/01047 possono essere una fonte particolarmente ricca di anticorpi anti-auto. Per ottenere questi rari anticorpi anti-self è necessaria una procedura di selezione di grande potenza, come quella fornita dagli anticorpi fagici. tali specificità anti-auto possono derivare dalla combinazione nella libreria di un dominio VH con un dominio VL per dare una specificità che normalmente viene cancellata se si verifica in natura. Per questo motivo, le librerie combinatorie e le librerie "chain-shuffled" come descritte nelle domande di brevetto WO92/01047 possono essere una fonte particolarmente ricca di anticorpi anti-auto. Per ottenere questi rari anticorpi anti-self è necessaria una procedura di selezione di grande potenza, come quella fornita dagli anticorpi fagici. tali specificità anti-self possono derivare dalla combinazione nella libreria di un dominio VH con un dominio VL per dare una specificità che normalmente viene cancellata se si verifica in natura. Per questo motivo, le librerie combinatorie e le librerie "chain-shuffled" come descritte nelle domande di brevetto WO92/01047 possono essere una fonte particolarmente ricca di anticorpi anti-auto. Per ottenere questi rari anticorpi anti-self è necessaria una procedura di selezione di grande potenza, come quella fornita dagli anticorpi fagici.
[0017]
Il grado di mutazione somatica osservato nei frammenti di anticorpi antiself isolati con la tecnologia dei fagi in questa applicazione indica che alcuni hanno sequenze germinali e sono quindi derivati ​​da cellule B vergini. Altri anticorpi isolati dalla tecnologia degli anticorpi fagici in questa applicazione mostrano un'ipermutazione somatica che indica che i geni V sono stati stimolati dall'antigene, un antigene cross-reattivo estraneo o altri antigeni estranei. In entrambi i casi i frammenti anticorpali isolati utilizzando la tecnologia fagica saranno solitamente una combinazione di domini VH e VL non originariamente presenti nei linfociti B e il potere della tecnologia fagica, come descritto in questa domanda, consente il loro isolamento.
[0018]
Secondo la presente invenzione viene fornito un metodo per ottenere un membro di una specifica coppia di legame (membro sbp), il quale membro sbp ha un sito di legame per l'antigene con specificità di legame per un antigene che è un autoantigene di una specie di mammifero, il metodo comprendente:
(a) fornire una libreria di pacchetti di visualizzazione genetica replicabili (rgdps), ogni rgdp che mostra sulla sua superficie un membro sbp e ogni rgdp contenente acido nucleico con sequenza derivata da dette specie di mammifero e codificante una catena polipeptidica che è una parte componente di il membro sbp visualizzato sulla superficie di tale rgdp;
(b) selezionare, legandosi con detto autoantigene, uno o più membri sbp con specificità di legame per detto autoantigene.
[0021]
La parte componente polipeptidica codificata dall'acido nucleico in ciascun rgdp può essere un dominio VH o VL di un anticorpo, o qualsiasi parte di un anticorpo che, da sola o in combinazione con una o più altre parti componenti, forma un frammento di anticorpo che è in grado di legare un antigene. Esempi di catene polipeptidiche che possono essere utilizzate come parti componenti di un membro sbp come sopra descritto includono pertanto, oltre ai domini VH e VL, V L C L , V H C H 1, frammenti scFv, frammenti Fab e così via.
[0022]
Ciascuno detto membro sbp visualizzato sulla superficie di un rgdp può essere un frammento di anticorpo comprendente un dominio V H e un dominio V L.
[0023]
Ciascun frammento di anticorpo può essere un frammento scFv, un frammento Fab, un frammento Fv costituito dal dominio V L e V H di un singolo braccio di un anticorpo, un ligando di legame a un singolo dominio costituito essenzialmente da o comprendente un dominio variabile a catena pesante ( Fd), o qualsiasi altro frammento che ha la capacità di legare un epitopo o un antigene.
[0024]
La fase di fornire una libreria di rgdps può comprendere:
combinando (i) una prima parte componente della catena polipeptidica di un membro sbp fusa con un componente di un rgdp che mostra così detta prima parte componente della catena polipeptidica o sua popolazione sulla superficie di rgdps all'espressione in un organismo di una cellula ospite ricombinante, o una popolazione di tale prima parte componente della catena polipeptidica fusa a detto componente di un rgdp, con (ii) una seconda parte componente della catena polipeptidica di un membro sbp o una popolazione di tale seconda parte componente della catena polipeptidica, per formare una libreria di membri sbp visualizzato sulla superficie di rgdps;
almeno una di detta prima o seconda parte componente della catena polipeptidica o sue popolazioni essendo codificata da acido nucleico che è in grado di essere confezionato utilizzando detto componente di un rgdp.
[0027]
La fase di fornire una libreria di rgdp può comprendere:
esprimere in un organismo ospite ricombinante una prima parte componente della catena polipeptidica di un membro sbp o una popolazione di tale prima parte componente della catena polipeptidica, fusa ad un componente di un rgdp che mostra così detta parte componente della catena polipeptidica sulla superficie di rgdps;
combinando detta prima parte componente della catena polipeptidica o popolazione con una seconda parte componente della catena polipeptidica di un membro sbp o una popolazione di tale seconda parte componente della catena polipeptidica, per formare una libreria di rgdps ciascuno che mostra un membro sbp sulla sua superficie, almeno uno di dette parti componenti la catena polipeptidica essendo espresse da acido nucleico che è in grado di essere confezionato utilizzando detto componente di un rgdp.
[0030]
Laddove il membro sbp è un frammento Fab, la prima e la seconda parte componente della catena polipeptidica possono essere un polipeptide costituito da un dominio V L e un dominio C L , e la seconda parte componente della catena polipeptidica un polipeptide costituita da un V H e un C H 1 dominio.
[0031]
La combinazione della prima e della seconda parte componente della catena polipeptidica o delle sue popolazioni può essere a livello di acido nucleico con vettori di espressione ciascuno avente introdotto in esso una sequenza codificante una prima parte componente e una sequenza codificante una parte componente della sequenza. D'altra parte, la combinazione può essere a livello polipeptidico con le prime parti componenti che non sono espresse dagli stessi vettori delle seconde parti componenti. Infatti, l'una o l'altra della prima e della seconda parte componente può essere fornita come libreria solubile. Dettagli sui vari formati che possono essere impiegati sono forniti in WO92/01047 e PCT/GB92/00883.
[0032]
La fase di fornitura di una libreria può comprendere:
combinando (i) acido nucleico che codifica un primo componente della catena polipeptidica di un membro sbp fuso ad un componente di un rgdp o una popolazione di tale prima parte componente della catena polipeptidica fusa ad un componente di un rgdp, con (ii) acido nucleico che codifica una seconda parte componente della catena polipeptidica di un membro sbp o una sua popolazione, per formare una libreria di acido nucleico, l'acido nucleico di detta libreria essendo in grado di essere confezionato usando detto componente di un rgdp;
esprimendo in un organismo ospite ricombinante detta prima parte componente della catena polipeptidica fusa ad un componente di un rgdp o sua popolazione e detta seconda parte componente della catena polipeptidica di un membro sbp o una sua popolazione, per produrre una libreria di rgdps ciascuno che mostra sulla sua superficie un elemento sbp e contenente acido nucleico codificante una prima e una seconda parte componente della catena polipeptidica dell'elemento sbp visualizzato sulla sua superficie.
[0035]
I lettori sono invitati a consultare WO92/01047, in particolare, se si desiderano ulteriori dettagli di qualsiasi metodo qui descritto.
[0036]
In una forma di realizzazione della presente invenzione, sia la prima che la seconda parte componente della catena polipeptidica o loro popolazioni sono espresse da acido nucleico in grado di essere confezionato utilizzando detto componente di un rgdp. Ciò potrebbe verificarsi quando le parti componenti insieme formano un frammento Fab o, più comunemente, quando ciascun detto membro sbp visualizzato sulla superficie di un rgdp è un frammento di anticorpo scFv.
[0037]
In una forma di realizzazione, ciascuna di detta seconda parte componente di catena polipeptidica o sua popolazione può essere espressa da acido nucleico separato dall'acido nucleico da cui è espressa detta prima parte componente o sua popolazione di catena polipeptidica. L'acido nucleico che codifica la prima parte componente della catena polipeptidica può trovarsi sullo stesso vettore di espressione dell'acido nucleico che codifica la seconda parte componente della catena polipeptidica, ma separato da esso in modo che, per esempio, vengano prodotti frammenti Fab. In alternativa, l'acido nucleico che codifica per la prima parte componente della catena polipeptidica può trovarsi su un vettore di espressione diverso dall'acido nucleico che codifica per una seconda parte componente della catena polipeptidica. Quando una prima e una seconda parte componente della catena polipeptidica sono entrambe codificate sullo stesso vettore di espressione, allora possono essere espresse come frammenti scFv,
[0038]
Ciascun membro sbp visualizzato sulla superficie di un rgdp è un frammento di anticorpo Fab.
[0039]
L'acido nucleico può essere derivato, ad esempio, da geni V riarrangiati di un mammifero non immunizzato, ad esempio un topo, ratto, coniglio, pecora, maiale, cavallo, capra, cane o essere umano. Preferibilmente la specie di mammifero è umana, poiché è più difficile ottenere anticorpi che riconoscano (cioè si leghino in modo specifico) antigeni self umani.
[0040]
L'acido nucleico può essere derivato da una libreria preparata mediante ricombinazione artificiale o sintetica di segmenti del gene V, che possono essere sequenze del gene V della linea germinale. La libreria può essere totalmente sintetica.
[0041]
I membri Sbp selezionati in (b) visualizzati sulla superficie di rgdps possono essere selezionati o vagliati per fornire un singolo membro sbp o una popolazione mista di detti membri sbp associati nei loro rispettivi rgdps con acido nucleico che codifica detto membro sbp o una sua catena polipeptidica. La fase Rgdp che mostra i membri sbp selezionati in (b) può essere cresciuta per aumentare il loro numero prima di qualsiasi successiva ulteriore selezione o screening. L'acido nucleico che codifica un membro sbp selezionato o schermato e che è derivato da un rgdp che mostra sulla sua superficie un membro sbp selezionato o schermato può essere usato per esprimere un membro sbp o un frammento di un suo derivato in un organismo ospite ricombinante.
[0042]
La presente invenzione comprende qualsiasi metodo in cui l'acido nucleico da uno o più rgdps selezionati dalla libreria legandosi con un autoantigene viene prelevato e utilizzato per fornire l'acido nucleico codificante in un ulteriore metodo (secondo qualsiasi forma di realizzazione della presente invenzione o meno) per ottenere un singolo membro sbp o una popolazione mista di membri sbp, o codificare acido nucleico per esso.
[0043]
L'espressione prodotto finale, membro sbp selezionato, può essere modificata per produrre un suo derivato.
[0044]
L'espressione prodotto finale o suo derivato può essere usata per preparare un medicamento terapeutico o profilattico o un prodotto diagnostico.
[0045]
La presente invenzione comprende anche frammenti di anticorpi, loro derivati, inclusi anticorpi interi e fusioni con enzimi, ottenuti utilizzando qualsiasi metodo qui descritto secondo la presente invenzione.
[0046]
Secondo un aspetto della presente invenzione viene fornito l'uso, in qualsiasi metodo secondo la forma di realizzazione della presente invenzione descritta h un kit comprendente una libreria di vettori ciascuno com acido nucleico che è in grado di essere packa e che codifica per una parte componente della catena polipeptidica di un anticorpo per la visualizzazione sulla superficie di rgdps.
[0047]
È anche fornito dalla presente invenzione l'uso, in qualsiasi metodo secondo qualsiasi forma di realizzazione della presente invenzione qui descritta, di un kit comprendente una libreria di rgdps ciascuno contenente acido nucleico che codifica almeno una parte componente della catena polipeptidica di un anticorpo.
[0048]
La presente invenzione fornisce generalmente un metodo per produrre un pacchetto di visualizzazione genetica replicabile (rgdps) o una popolazione di tali rgdps, il quale metodo comprende le fasi di:
[0049]
(a) inserire una sequenza nucleotidica codificante una molecola di legame che è un membro di una specifica coppia di legame e un anticorpo anti-sé, all'interno di un genoma virale;
[0050]
(b) coltivare il virus contenente detta sequenza nucleotidica in modo che detta molecola di legame sia espressa e visualizzata dal virus sulla sua superficie.
[0051]
La presente invenzione fornisce anche un metodo per selezionare un rgdp specifico per un particolare epitopo autoantigene che comprende la produzione di una popolazione di tali rgdps e la fase aggiuntiva di selezionare per detta molecola di legame che è un anticorpo anti-auto mettendo in contatto la popolazione con detto epitopo in modo che i singoli rgdps con la specificità desiderata possano legarsi a detto epitopo. Il metodo può comprendere una o più delle fasi aggiuntive di: (i) separare qualsiasi rgdps legato dall'epitopo; (ii) recuperare qualsiasi rgdps separato e (iii) utilizzare le sequenze nucleotidiche inserite da qualsiasi rgdps separato in un sistema ricombinante per produrre la molecola di legame separata dal virus. La fase di selezione può isolare la sequenza nucleotidica che codifica per la molecola di legame della specificità desiderata,
[0052]
La presente invenzione fornisce anche un metodo per produrre un membro multimerico di una coppia di legame specifica (sbp) che è un anticorpo anti-self, il quale metodo comprende: esprimere in un organismo ospite ricombinante una prima catena polipeptidica di detto membro sbp o un gene geneticamente diverso popolazione di detto membro sbp fusa a un componente di un pacchetto di visualizzazione genetica replicabile secreto (rgdp) che visualizza quindi detto polipeptide sulla superficie del pacchetto ed esprime in un organismo ospite ricombinante una seconda catena polipeptidica di detto multimero e causa o consente la le catene polipeptidiche si uniscono per formare detto multimero come parte di detto rgdp almeno una di dette catene polipeptidiche essendo espressa da acido nucleico che è in grado di essere confezionato utilizzando detto componente per esso,per cui il materiale genetico di ciascun detto rgdp codifica una detta catena polipeptidica.
[0053]
Entrambe dette catene possono essere espresse nello stesso organismo ospite.
[0054]
La prima e la seconda catena di detto multimero possono essere espresse come catene separate da un singolo vettore contenente il rispettivo acido nucleico.
[0055]
Almeno una di dette catene polipeptidiche (o parti componenti la catena polipeptidica) può essere espressa da un vettore fagico.
[0056]
Almeno una di dette catene polipeptidiche può essere espressa da un vettore fagemidico, il metodo includendo l'uso di un fago aiutante, o un plasmide che esprime geni fagi complementari, per aiutare a confezionare detto genoma fagemidico, e detto componente del rgdp è una proteina del capside per questo. La proteina del capside può essere assente, difettosa o condizionatamente difettosa nel fago helper.
[0057]
Il metodo può comprendere l'introduzione di un vettore in grado di esprimere detta prima catena polipeptidica, in un organismo ospite che esprime detta seconda catena polipeptidica in forma libera, o l'introduzione di un vettore in grado di esprimere detto secondo polipeptide in forma libera in un organismo ospite che esprime detta prima catena polipeptidica. catena polipeptidica.
[0058]
Ciascuna delle catene polipeptidiche può essere espressa da acido nucleico che è in grado di essere confezionato come rgdp usando detto prodotto di fusione del componente, per cui l'acido nucleico codificante per entrambe dette catene polipeptidiche è confezionato in rispettivi rgdps.
[0059]
Le fusioni possono essere espresse in assenza della componente di visualizzazione rgdp, forse capside, espressa in forma wild-type.
[0060]
La proteina del capside può essere assente, difettosa o condizionatamente difettosa nel fago helper.
[0061]
La cellula ospite può essere un ceppo mutatore che introduce diversità genetica nell'acido nucleico membro sbp.
[0062]
Il rgdp può essere un batteriofago, l'ospite un batterio e detto componente del rgdp una proteina del capside per il batteriofago. Il fago può essere un fago filamentoso. Il fago può essere selezionato tra i fagi di classe I fd, M13, f1, If1, lke, ZJ/Z, Ff e le fasi di classe II Xf, Pf1 e Pf3. Il fago può essere fd o un derivato di fd. Il derivato può essere resistente alla tetraciclina. Detto membro sbp o sua catena polipeptidica man è espresso come fusione con la proteina capside del gene III del fago fd o la sua controparte in un altro fago filamentoso. Il membro sbp o la sua catena polipeptidica possono essere inseriti nella regione N-terminale della proteina capside matura a valle di un peptide leader di secrezione. La sequenza può essere inserita dopo l'aminoacido +1 della proteina matura.
[0063]
L'ospite potrebbe essere E. coli.
[0064]
L'abed nucleico che codifica un polipeptide membro sbp può essere collegato a valle a una proteina del capside virale attraverso un codone di stop traslazionale soppressibile, in modo che in condizioni in cui lo stop è soppresso vengono prodotte proteine ​​di fusione comprendenti il ​​polipeptide membro sbp e la proteina capside virale, mentre in condizioni di non soppressione condizioni vengono prodotti polipeptidi membri sbp in forma libera.
[0065]
I sistemi di selezione e i formati di analisi sono discussi altrove in questo testo. In questi sistemi e formati, la sequenza genica che codifica per la molecola legante (ad es. l'anticorpo) di specificità desiderata è separata da una popolazione generale di rgdps avente un intervallo di specifiche, per il fatto del suo legame a un bersaglio specifico (ad es. l'antigene o epitopo). Pertanto, gli rgdps formati da detta espressione possono essere selezionati o vagliati per fornire un singolo membro sbp o una popolazione mista selezionata di detti membri sbp associati nei loro rispettivi rgdps con acido nucleico che codifica detto membro sbp o una sua catena polipeptidica. Il rgdps può essere selezionato per affinità con un membro complementare a detto membro sbp.
[0066]
Eventuali rgdps legati a detto secondo elemento possono essere recuperati mediante lavaggio con un eluente. Le condizioni di lavaggio possono essere variate al fine di ottenere rgdps con differenti affinità di legame per detto epitopo. In alternativa, per ottenere ad esempio rgdps ad alta affinità, il membro complementare (ad esempio un epitopo) può essere presentato alla popolazione di rgdps (ad esempio pAbs) già legato a un membro legante, nel qual caso pAb con una maggiore affinità per l'epitopo sostituiranno il già membro vincolante vincolato. Così l'eluente può contenere una molecola che compete con detto rgdp per legarsi al membro complementare sbp. Il rgdp può essere applicato a detto membro sbp complementare in presenza di una molecola che compete con detto pacchetto per legarsi a detto membro sbp complementare. L'acido nucleico derivato da un rgdp selezionato o selezionato può essere usato per esprimere detto membro sbp o un suo frammento o derivato in un organismo ospite ricombinante. L'acido nucleico da uno o più rgdps può essere prelevato e utilizzato per fornire acido nucleico codificante in un ulteriore detto metodo per ottenere un singolo membro sbp o una popolazione mista di membri sbp, o codificare acido nucleico per esso. L'espressione prodotto finale può essere modificata per produrre un suo derivato.
[0067]
Una fonte preferita per la generazione di librerie diverse da esseri umani non immunizzati è l'mRNA di IgM. È stato trovato nell'esempio 43 di WO92/01047 che i frammenti anticorpali diretti contro il lisozima dell'uovo di tacchino e il 2-fenil-5-ossazolone sono stati isolati molto più facilmente da una libreria fagica derivata dall'mRNA di IgM da donatori umani non immunizzati, che da uno preparato dall'mRNA delle IgG. Inoltre, nessun frammento di anticorpo legante il 2-fenil-5-ossazolone potrebbe essere isolato da una libreria di 2000000 cloni di anticorpi fagici preparati da IgGmRNA di topi non immunizzati (T. Clackson et al, Nature 352 624-628.1991). Gli esempi da 1 a 3 di questa domanda mostrano l'isolamento di anticorpi specifici per l'autoantigene dalla libreria di IgM. Sebbene in questi campioni, le specificità antiself siano state selezionate come frammenti Fv a catena singola in un unico formato replicone,
[0068]
Possono essere preparate librerie di fagi che sono arricchite per anticorpi diretti contro il sé. I linfociti B esprimono IgM di superficie e IgD di superficie prima della stimolazione con l'antigene, ma esprimono IgM o IgD poco solubili. Queste cellule non stimolate hanno maggiori probabilità di contenere geni anticorpali con specificità anti-auto. Al contrario, le plasmacellule differenziate terminali che secernono anticorpi solubili esprimono poca immunoglobulina di superficie. La preparazione di cDNA per la preparazione della libreria fagica utilizzando primer specifici per IgM o IgD di superficie produrrà un repertorio di geni anticorpali arricchiti per i geni naive e non selezionati che codificano per i domini V. Nei linfociti B che sono stati funzionalmente silenziati dall'esposizione a sé vi sono livelli notevolmente ridotti di IgM di superficie ma livelli invariati di IgD di superficie (CC Goodnow et al. supra). Quindi,
[0069]
Tuttavia, come dimostrato in questa domanda, l'mRNA di IgM da linfociti del sangue periferico non selezionati è una fonte preferita di geni V per le specificità antiself. Altre fonti di tali anticorpi anti-auto possono essere mRNA fetale o mRNA del sangue cordonale (PM Lydyard et al Scand J Immunol 31 33-43, 1990).
[0070]
Esiste la possibilità di creare repertori per la visualizzazione dei fagi utilizzando la combinazione originale di domini VH e VL mediante l'uso della PCR e il collegamento dei geni che li codificano all'interno delle cellule che esprimono questi domini. Il principio di "In cell PCR", in cui viene mantenuto l'accoppiamento VH/VL originale, è stato dimostrato in PCT/GB92/01483 e descritto in Embleton et al in Nucleic Acids Res., 20, 3831-3837, 1992. Questo può essere particolarmente utile se i linfociti possono essere selezionati in una fase precedente alla delezione di cloni che esprimono anticorpi anti-self.
[0071]
In una forma di realizzazione di questa invenzione, possono essere usate sequenze di geni V, o anche librerie preparate dalla ricombinazione sintetica di segmenti V, D e J. Questi agiscono come una ricca fonte di anticorpi anti-auto. Negli esempi da 5 a 7, dimostriamo che le specificità anti-auto contro TNF, l'anticorpo umano anti-rhesus D (OAK3) e la tireoglobulina umana possono essere isolate da una libreria di anticorpi fagici preparata dall'unione sintetica dei segmenti V. D e J. L'uso di geni della linea germinale V per questo scopo, come mostrato negli esempi da 5 a 7, dovrebbe essere prezioso per l'isolamento di anticorpi anti-self in quanto vi sono alcune prove che i linfociti B diretti contro antigeni self solubili sono funzionalmente silenziati e quelli diretti contro autoantigene legato alla membrana multivalente vengono eliminati (SB Hartley et al supra; DM Russell et al, supra). Così,
[0072]
Negli esempi da 5 a 7 abbiamo utilizzato segmenti sintetici VH CDR3 che incorporano sequenze di basi casuali nella regione di giunzione VDJ e li abbiamo collegati ai segmenti del gene VH della linea germinale. Possono essere utilizzate altre strategie come realizzare ciascuno dei loop CDR di sequenza casuale o realizzare i loop CDR di strutture canoniche note (C. Chothia et al, Nature 342 877-893, 1989) e incorporare elementi di sequenza casuali. La natura della linea germinale dei segmenti V e J potrebbe essere alterata incorporando alterazioni specifiche o casuali alla sequenza o utilizzando regioni del gene V somaticamente mutate. La strategia utilizzata negli esempi da 5 a 7 ha il vantaggio che le strutture ad anello dei segmenti del gene V formano solo un numero limitato di pieghe distinte e combinazioni di pieghe (C. Chothia et al J. Mol. Biol. 227 779-817, 1992) e presumibilmente si sono evoluti per la stabilità e per creare una distribuzione e una gamma di siti di legame ben adatti per adattarsi alla struttura degli antigeni. Inoltre, è probabile che le regioni della struttura e le prime due anse ipervariabili delle catene pesanti e leggere degli anticorpi umani sintetici siano identiche in molti individui diversi. Tali anticorpi umani sintetici potrebbero essere meno immunogenici di strutture interamente artificiali.
[0073]
Un'ulteriore ma meno preferita alternativa alle librerie di visualizzazione dei fagi naturali e sintetiche di cui sopra sarebbe quella di preparare librerie di mutagenesi casuali visualizzate sul fago, derivate da una o poche molecole di anticorpi umani e selezionando le specificità dell'antigene anti-auto da queste.
Selezione
[0074]
I singoli rgdps, ad es. pAb che esprimono la specificità desiderata per un antigene, possono essere isolati da una libreria utilizzando le tecniche di screening convenzionali (ad es. come descritto in Harlow, E. e Lane, D., 1988, supra Gherardi, E et al. 1990. J. Immunol. meth. 126 p61-68).
[0075]
I richiedenti hanno anche ideato tecniche di selezione praticabili grazie alle proprietà uniche di rgdps. Lo schema generale di alcune procedure di screening è illustrato inFICO. 5 usando pAbs come tipo di esempio di rgdp.
[0076]
La popolazione/biblioteca di pAb da sottoporre a screening potrebbe essere generata da animali immunizzati o di altro tipo; o essere creato in vitro mediante la mutagenesi di anticorpi fagici preesistenti (usando tecniche ben note nell'arte come la mutagenesi diretta da oligonucleotidi (Sambrook, J., et al., 1989 Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) ma sono preferibilmente derivati ​​da esseri umani o artificiali non immunizzati. ricombinazione di segmenti V umani, come descritto altrove. Questa popolazione può essere esaminata in uno o più dei formati descritti di seguito con riferimento aFICO. 5, per derivare quei singoli pAb le cui proprietà di legame all'antigene sono diverse dal campione c.
Eluizione vincolante
[0077]
FICO. 5( i ) mostra l'antigene (ag) legato a una superficie solida (s) la superficie solida (s) può essere fornita da una capsula di Petri, sfere per cromatografia, sfere magnetiche e simili. La popolazione/libreria di pAbs viene quindi passata sopra ag, e quegli individui p che si legano vengono trattenuti dopo il lavaggio, e facoltativamente rilevati con il sistema di rilevamento d. Può essere utilizzato un sistema di rilevamento basato su antisieri anti-fd (si veda, ad esempio, l'Esempio 4 di W092/01047). Se i campioni della popolazione legata p vengono rimossi in condizioni sempre più rigorose, l'affinità di legame rappresentata in ciascun campione aumenterà. Si possono ottenere condizioni di maggiore stringenza, ad esempio, aumentando il tempo di ammollo o modificando il pH della soluzione di ammollo, ecc.
concorrenza


Un metodo per ottenere un membro di una specifica coppia di legame (membro sbp), il membro sbp essendo un anticorpo o frammento di anticorpo e avente un sito di legame dell'antigene con specificità di legame per un antigene che è un auto antigene di una specie di mammifero, il metodo comprendente:
(a) fornire una libreria di pacchetti di visualizzazione genetica replicabili (rgdps), ogni rgdp che mostra sulla sua superficie un membro sbp e ogni rgdp contenente acido nucleico con sequenza derivata da dette specie di mammifero e codificante una catena polipeptidica che è una parte componente di il membro sbp visualizzato sulla superficie di tale rgdp;
(b) selezionare, legandosi con detto autoantigene, uno o più membri sbp con specificità di legame per detto autoantigene.
2 . Un metodo secondorivendicazione 1 in cui ciascun detto membro sbp visualizzato sulla superficie di un rgdp è un frammento di anticorpo comprendente un dominio VH e un dominio VL.
3 . Un metodo secondorivendicazione 2 in cui ciascun detto membro sbp visualizzato sulla superficie di un rgdp è un frammento di anticorpo scFv.
4 . Un metodo secondorivendicazione 2 in cui ciascun detto membro sbp visualizzato sulla superficie di un rgdp è un frammento di anticorpo Fab.
5 . Un metodo secondorivendicazione 1 in cui l'acido nucleico è derivato da geni V riarrangiati di un mammifero non immunizzato.
6 . Un metodo secondorivendicazione 1 in cui l'acido nucleico è derivato da una libreria preparata mediante ricombinazione artificiale o sintetica di sequenze del gene V.
7 . Un metodo secondorivendicazione 6 in cui la libreria è derivata da sequenze di geni V della linea germinale.
8 . Un metodo secondorivendicazione 1 in cui detta specie di mammifero è umana.
9 . Un metodo secondorivendicazione 1 in cui i membri sbp selezionati in (b) visualizzati sulla superficie di rgdps sono selezionati o vagliati per fornire un singolo rgdp che mostra un membro sbp o una popolazione mista di detti rgdps, con ciascun rgdp contenente acido nucleico che codifica il membro sbp o una sua catena polipeptidica che viene visualizzato sulla sua superficie.
10 . Un metodo secondorivendicare 9 in cui l'acido nucleico che codifica un membro sbp selezionato o schermato e che è derivato da un rgdp che mostra sulla sua superficie un membro sbp selezionato o schermato è usato per esprimere un membro sbp o un suo frammento o derivato in un organismo ospite ricombinante.
11 . Un metodo secondopretendere 10 in cui l'acido nucleico da uno o più rgdps viene prelevato e utilizzato per fornire acido nucleico codificante in un ulteriore metodo per ottenere un singolo membro sbp o una popolazione mista di membri sbp, o codificare acido nucleico per esso.
12 . Un metodo secondopretendere 10 in cui l'espressione prodotto finale è modificata per produrre un suo derivato.
13 . Un metodo secondopretendere 10 in cui l'espressione prodotto finale o suo derivato è usata per preparare un medicamento terapeutico o profilattico o un prodotto diagnostico.