BANCA DATI: FAGO M13 - Collegato a Morgellons - I computer superveloci del futuro funzioneranno grazie a un virus biologico

(Continuo da sopra)
Descrizione dettagliata dell'invenzione
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È desiderabile identificare polipeptidi, in particolare frammenti di anticorpi, che siano di origine umana, solubili, stabili, resistenti all'aggregazione, ripiegabili, altamente espressi, facilmente manipolabili a livello di DNA, ideali per la costruzione di librerie e per determinazioni strutturali 3-D. Tali frammenti di anticorpi sono utili per un'ampia varietà di applicazioni immunoterapeutiche e anche come agenti diagnostici e di rilevamento. Gli anticorpi monomerici umani V H e V L sono di particolare interesse, poiché è probabile che abbiano molte delle proprietà sopra menzionate.
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I polipeptidi con le proprietà sopra menzionate possono essere identificati mediante screening ad alto rendimento di librerie in grado di esprimere una varietà di sequenze polipeptidiche. Ad esempio, le librerie di visualizzazione dei fagi (preferibilmente fagi filamentosi come M13 o fd) possono essere schermate infettando un campo di batteri suscettibili al fago (un prato batterico) con il fago, quindi determinando quali fagi hanno lisato con successo i batteri cercando aree chiare e prive di batteri note come placche. I fagi che espongono monomerica llaminated V H s e V L s formano grandi placche su prati batteriche di fagi visualizzazione pienamente umano V H s con tendenze di aggregazione. Pertanto, la dimensione della placca può essere utilizzata come mezzo per identificare il raro monomero V H . presente in naturas e V L s dal repertorio umano V H.
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Il metodo qui divulgato è anche utile per identificare solubili, stabili (la stabilità copre una serie di caratteristiche, incluso ma non limitato a elevata efficienza di ripiegamento termico, alta temperatura di fusione, mantenimento della funzionalità dopo lunga (diversi giorni) incubazione a 37 ° C, resistente a denaturanti chimici, resistenti alle proteasi, aventi una lunga durata di conservazione al di sotto di 0°C e 4°C, e a temperatura ambiente, mantenendo la funzionalità negli ambienti intracellulari e mantenendo la funzionalità all'interno del corpo umano, come nel flusso sanguigno) e alta che esprimono proteine ​​di diversa origine, tra cui:
1. V H s, V L s, Fab, scFv e anticorpi interi come IgG, più specificamente umani
2. Varianti proteiche basate su scaffold non anticorpali recettori delle cellule T a catena singola, domini dei recettori delle cellule T, transferina, lipocaline, domini kunitz, ripetizioni di anchirina e antigene citotossico associato ai linfociti T (CTLA-4), incluso l'uomo quelli
3. Vaccini come i vaccini proteici virali e batterici
4. Proteine ​​terapeutiche, ad es. insulina, ormone della crescita, aritropoietina
5. Reagenti diagnostici e biochimici proteici, ad es. proteina A, proteina G.
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Una volta che i polipeptidi sono stati identificati con questo metodo, possono essere utilizzati per costruire librerie aggiuntive. Questo viene fatto selezionando una sequenza di acido nucleico di, per esempio, un VH. Gli oligonucleotidi con codoni randomizzati vengono creati e incorporati nella sequenza VH. Pertanto, ogni oligonucleotide unico è incorporato in un gene VH e i geni VH modificati costituiscono una libreria di sequenze con lievi variazioni. Tipicamente, gli oligonucleotidi sono progettati in modo tale che i CDR o i loop del VH siano randomizzati. Ad esempio, uno, due o tutti e tre i CDR VH possono essere randomizzati. La libreria VH viene quindi clonata in un vettore appropriato, a seconda del tipo di libreria da utilizzare, e le sequenze di acido nucleico sono espresse come polipeptidi. La libreria viene vagliata per le molecole che si legano ai polipeptidi della libreria, in genere mediante panning.
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I polipeptidi identificati dal metodo qui discusso possono essere usati per l'immunoterapia, per esempio, la reticolazione di monomeri per formare dimeri, trimeri, pentameri e altri multimeri. Ciò può comportare una migliore affinità per le molecole di antigene e tassi di dissociazione più lenti per alcuni antigeni. Un altro possibile approccio è collegare o fondere polipeptidi a una varietà di molecole con varie funzioni. Ad esempio, frammenti di anticorpi possono essere collegati a radionuclidi, farmaci citotossici, tossine, peptidi, proteine, enzimi, liposomi, lipidi, superantigeni o virus delle cellule T per colpire e distruggere o modificare cellule o molecole specifiche.
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Una volta che i V H s o V L s identificati dal metodo di selezione qui descritto sono stati isolati, possono essere ulteriormente manipolati per selezionare proprietà biofisiche migliorate come solubilità, stabilità, monomericità, specificità di legame, origine umana o alta espressibilità. Ciò può essere ottenuto mediante tecniche di ricombinazione in vitro come il rimescolamento del DNA o un processo di estensione sfalsato. Il rimescolamento del DNA comporta il taglio della sequenza dell'acido nucleico del primo (donatore) e del secondo (accettore) polipeptidi, come i frammenti di anticorpi, in frammenti casuali, quindi riassemblando i frammenti casuali mediante una reazione simile alla PCR. I frammenti riassemblati vengono quindi vagliati per selezionare le proprietà desiderate.
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Ad esempio, uno o più VH con elevata stabilità (donatori) possono essere miscelati con uno o più VH privi di sufficiente stabilità (accettori) e sottoposti a rimescolamento del DNA. Questo genera mutanti dei VH accettori che hanno incorporato residui di stabilità dai VH donatori. I nuovi mutanti stabili possono essere identificati mediante i metodi descritti nel presente documento, o attraverso altri sistemi di screening proteici evolutivi come visualizzazione ribosomiale, visualizzazione lievito, visualizzazione cellule batteriche e visualizzazione fagica. Allo stesso modo, questa tecnica può essere utilizzata per trasferire tratti desiderabili come solubilità, monomericità e alta espressione.
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Questa tecnica può essere utilizzata dove sia il donatore che l'accettore V H hanno proprietà desiderabili, per produrre un V H con entrambe le proprietà. Ad esempio, un donatore instabile V H che si lega a un importante ligando terapeutico o diagnostico può essere mescolato con un accettore stabile V H . Al fine di garantire che le nuove stabile generato V H s hanno anche la capacità di legarsi al ligando, il sistema di screening può comportare una fase di legame ligando.
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DNA shuffling può anche essere utile per umanizzare non umano V H s come catena pesante domini variabili dell'anticorpo camelidi e infermiere squali e domini variabili squalo wobbegong o non umani V L s che si legano a bersagli terapeutici. V H s e V L s umani con proprietà desiderabili come solubilità, stabilità, monomericità e alta esprimibilità possono essere usati come donatori. Ad esempio, uno o più V H s umani con buona stabilità (donatori) possono essere miscelati con uno o più V H terapeutici non umani (accettori) e sottoposti a rimescolamento del DNA. Questo genera mutanti dell'accettore V Hs che sono sia stabili che umanizzati. I mutanti umanizzati e stabili di nuova generazione possono essere identificati mediante i metodi descritti nel presente documento, o attraverso altri sistemi di screening proteici evolutivi come visualizzazione di ribosomi, visualizzazione di lieviti, visualizzazione di cellule batteriche e visualizzazione di fagi. In un ulteriore esempio, l'accettore V H potrebbe essere un V H H terapeutico (dominio variabile dell'anticorpo della catena pesante camelide).
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Inoltre, questa tecnica è anche utile per selezionare proprietà desiderabili di polipeptidi diversi da V H s e V L s. Come discusso sopra, il polipeptide donatore e il polipeptide accettore possono essere entrambi umani, oppure il donatore può essere umano e l'accettore non umano.
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Un possibile approccio per conferire solubilità, monomericità, elevata espressibilità o stabilità a V H s e V L s può essere attraverso l'innesto di regioni determinanti la complementarità (CDR) sull'accettore V H S e V L s. Poiché è noto che le CDR sono coinvolte nella solubilità e stabilità degli anticorpi a dominio singolo, e di conseguenza l'innesto di queste regioni, come le CDR da V H s e V L s isolate con i metodi descritti nel presente documento, può conferire solubilità e/o o stabilità all'accettore V H s e V L s.
Umano Monomerico V H s e V L s
aggettivo
In chimica, proprio di un monomero o relativo a un monomero.
Unità monomerica (o residuo monomerico ), il raggruppamento costitutivo dei polimeri, che si ripete lungo la catena polimerica, derivabile dalla molecola del monomero dopo la sua unione con altre molecole identiche o diverse nel processo di polimerizzazione.


Col termine monomero in chimica si definisce una molecola semplice dotata di gruppi funzionali tali da renderla in grado di combinarsi ricorsivamente con altre molecole a formare macromolecole. Per estensione, il termine viene usato anche per identificare l'unità strutturale ripetitiva che forma un polimero.

Monomero
Col termine monomero (dal greco una parte) in chimica si definisce una molecola semplice dotata di gruppi funzionali tali da renderla in grado di combinarsi ricorsivamente con altre molecole (identiche a sé o reattivamente complementari a sé) a formare macromolecole.

Per estensione, il termine viene usato anche per identificare l'unità strutturale ripetitiva che forma un polimero (detta più propriamente "unità ripetitiva" del polimero).

Il processo di trasformazione del monomero a polimero si chiama polimerizzazione

Quando i monomeri vengono utilizzati per produrre copolimeri, si utilizza più precisamente il termine comonomero.
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Diversi monomerica umano V H s con differenti linea germinale e tuta sequenze sono stati identificati (seeFigura 1e SEQ ID NO. da 8 a 22) da una libreria di visualizzazione fagica V H umana ingenua con questo metodo di selezione basato sulla dimensione della placca fagica. I VH rimangono funzionali e monomerici dopo trattamento con tripsina a 37°C, settimane di incubazione a 37°C o mesi di conservazione a 4°C, hanno elevate efficienze di ripiegamento termico, sono prodotti con buone rese in E. coli e possiedono proteine Un'attività vincolante.
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Inoltre, diversi monomeriche umano V L s sono stati identificati (seeFigura 6e SEQ ID NO. da 23 a 54). I V L s sono prodotti con buone rese anche in E. coli e possiedono attività legante la proteina L.
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Tali proprietà saranno anche manifestate da V H s da librerie sintetiche che utilizzano i suddetti V H s come scaffold. Pertanto, tali librerie possono fornire V H terapeutiche o diagnostiche che avrebbero una buona efficacia a temperatura fisiologica, una durata di conservazione estesa e una produzione economicamente vantaggiosa. L'elevata efficienza di ripiegamento termico estenderebbe ulteriormente le applicazioni biotecnologiche di queste librerie a situazioni in cui i leganti V H sono necessari per mantenere la loro attività dopo l'esposizione a temperature elevate transitorie. I V H s dovrebbero anche essere molto adatti per applicazioni intracorporee a causa delle loro proprietà biofisiche desiderabili. La proprietà di legame della proteina A semplificherà V Hla purificazione e la rilevazione in test diagnostici, immunoblotting e immunoistochimica e può essere sfruttata per migliorare le prestazioni libreria rimuovendo non funzionali V H s dalle librerie. Allo stesso modo, le librerie che utilizzano V L s come supporti produrrà terapeutici o diagnostici V L s che hanno proprietà desiderabili simile. Poiché V L s si lega alla proteina L, la purificazione e il rilevamento di V L è semplificata sfruttando questa proprietà di legame della proteina L.
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Le librerie di visualizzazione costruite sugli attuali V H s e V L s possono anche essere un'utile fonte di diagnostica e agenti di rilevamento.
[0040]
Precedentemente riportato pienamente umana V H s con favorevoli proprietà biofisiche erano basati su una singola sequenza V germinale: DP-47 (( Jespers, L. et al. 2004b; Jespers, L. et al , 2004a).. L'osservazione che la Le V H umane monomeriche in questo studio derivano da sei diverse sequenze germinali tra cui DP-47, dimostra che le V H stabili non sono limitate in termini di utilizzo del gene della linea germinale.In effetti, è molto probabile che avremmo isolato V H monomeriche s della famiglia e le origini della linea germinale diverse da quelle che descriviamo qui se non avessimo la nostra selezione ristretta a un sottoinsieme di V H 3 famiglia V Hs con attività di legame alla proteina A. Non è possibile individuare mutazioni amminoacidiche ( Tabella 1) responsabili del comportamento biofisico osservato degli attuali VHs a causa del verificarsi di mutazioni multiple in VHs e del fatto che anche CDR3 è noto per essere coinvolto nella formazione del profili biofisici di sdAbs. Tuttavia, può essere che mutazioni in posizioni note per essere importanti per la stabilità e la solubilità di sdAbs, ad esempio V37F in HVHP423 e HVHP44B, o mutazioni che si verificano più volte nella stessa posizione, ad esempio L5V/Q e V5Q in nove V H s, hanno un ruolo nel determinare le proprietà biofisiche di V H s. In termini di costruzione della biblioteca, sarebbe desiderabile che la monomericità dell'attuale V Hs non dipende da CDR, in particolare CDR3, in modo che la randomizzazione CDR venga eseguita senza la preoccupazione di compromettere la stabilità della libreria. A questo proposito, i V H s con CDR3 più piccoli, ad esempio HVHB82, possono essere scaffold preferiti poiché ci sarebbe meno dipendenza da CDR3 per la stabilità.
[0041]
La diversità degli attuali V H s e V L s in termini di sequenza complessiva e lunghezza CDR3 dovrebbe consentire la costruzione di librerie più performanti. Sintetici V H librerie sono state costruite su singoli ponteggi. Un tale approccio alla generazione del repertorio è in netto contrasto con il naturale "approccio" in vivo che utilizza una molteplicità di scaffold. Sulla base delle sequenze qui riportate si può sfruttare la disponibilità del diverso insieme di V H s e V L s e creare librerie che si basano su più scaffold V H e V L. Tali librerie sarebbero una migliore emulazione di in vivorepertori e, quindi, avrebbe una complessità più ottimale. Dei tre CDR in sdAbs, CDR3 generalmente contribuisce in modo più significativo alla diversità del repertorio e per questo motivo la randomizzazione di CDR3 su scaffold V H e V L è tipicamente accompagnata da variazioni concomitanti della lunghezza di CDR3. Sebbene ciò migliori significativamente la complessità della libreria, può anche compromettere la stabilità della libreria interrompendo la lunghezza dell'impalcatura parentale CDR3. L'eterogeneità dei V H s e V Ls qui descritti in termini di lunghezza CDR3 consentono la creazione di librerie con sia buona complessità, buona stabilità e buone caratteristiche biofisiche. Tali librerie sarebbero preferibilmente costituite da sottobiblioteche, in cui ciascuna sottobiblioteca viene creata mediante randomizzazione CDR3 (e randomizzazione CDR1 e/o CDR2, se lo si desidera) su un singolo scaffold V H o V L senza interrompere la lunghezza CDR3 parentale.
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La versatilità degli attuali V H s e V L s è anche vantaggiosa in termini di scelta di un quadro ottimale V H o V L per umanizzare V H H , V H e V L , specifici per obiettivi terapeutici. I camelidi V H H ad alta affinità contro bersagli terapeutici possono essere ottenuti da librerie V H H immuni, non immunizzati o sintetici con relativa facilità ed essere successivamente sottoposti a umanizzazione (innesto CDR, resurfacing, deimmunizzazione) per rimuovere l'eventuale immunogenicità V H H, quindi fornire un'alternativa a V umana H approccio libreria per la produzione di V terapeuticoH s. La generazione di V H terapeutici ad alta affinità mediante quest'ultimo approccio può spesso richiedere una maturazione dell'affinità in vitro aggiuntiva, noiosa e dispendiosa in termini di tempo, dei leganti di piombo selezionati dalle librerie sintetiche primarie di V H umane .
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I V H non umani contro bersagli terapeutici possono essere ottenuti da librerie V H immuni, non immunizzati o sintetici con relativa facilità ed essere successivamente sottoposti a umanizzazione (innesto CDR, resurfacing, deimmunizzazione) per eliminare l' immunogenicità V H non umana , fornendo quindi un'alternativa a approccio alla libreria umana V H per la produzione di V H terapeutici .
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I V L non umani contro bersagli terapeutici possono essere ottenuti da librerie V H H immuni, non immunizzati o sintetici con relativa facilità ed essere successivamente sottoposti a umanizzazione (innesto CDR, resurfacing, deimmunizzazione) per eliminare l' immunogenicità V H H, fornendo quindi un'alternativa a V umana L approccio libreria per la produzione di terapeutici V L s.
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Sono stati descritti numerosi approcci evolutivi per la selezione di proteine ​​con proprietà biofisiche migliorate (Forrer, P. et al ., 1999;Waldo, GS, 2003); (Jespers, L. et al , 2004a;. Jung, S. et al / ,. 1999 Matsuura, T. et al / ,. 2003). In genere, è necessaria una pressione di stabilità per garantire la selezione preferenziale di varianti stabili rispetto a quelle instabili o meno stabili da una popolazione di librerie. Ad esempio, in un lavoro correlato, è stato richiesto il trattamento termico delle librerie di visualizzazione fagica V H per selezionare V H s resistenti all'aggregazione (Jespers, L. et al., 2004a). Esempi di approcci di selezione evolutiva che coinvolgono la visualizzazione dei fagi includono la visualizzazione dei fagi convenzionale, i fagi selettivamente infettivi e gli approcci di proteolisi. Nei primi due approcci la selezione dell'affinità viene utilizzata per selezionare specie stabili da una libreria, sulla base dell'assunto che le proteine ​​stabili possiedano migliori proprietà di legame per il loro ligando rispetto a quelle instabili. Tuttavia, anche con l'inclusione aggiuntiva di una fase di selezione della stabilità, questi approcci possono principalmente arricchire per una maggiore affinità piuttosto che per una maggiore stabilità (Jung, S. et al., 1999).Un requisito della fase di legame limita anche l'applicabilità di questi approcci alle proteine ​​con ligandi noti. Il terzo approccio, la proteolisi, si basa sul fatto che le proteine ​​stabili sono generalmente compatte e quindi resistenti alle proteasi mentre quelle instabili non lo sono. Il formato di visualizzazione dei fagi è progettato in modo tale che la stabilità della proteasi della proteina visualizzata si traduca in infettività dei fagi. Pertanto, quando una libreria di visualizzazione fagica variante viene trattata con una proteasi, solo i fagi che mostrano proteine ​​stabili mantengono la loro infettività e possono successivamente essere selezionati infettando un E. coliospite. Poiché questo approccio è indipendente dal legame con il ligando, ha un'utilità generale. Tuttavia, anche le proteine ​​stabili e ben ripiegate hanno siti sensibili alla proteasi, ad esempio anse e linker, e questo a volte potrebbe ostacolare la selezione di specie stabili in un approccio di proteolisi ( Bai, Y. et al., 2004 ).
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Al contrario, nell'attuale approccio evolutivo, le proteine ​​con proprietà biofisiche superiori sono semplicemente identificate ad occhio nudo. L'approccio non richiede il legame del ligando, la proteolisi o le fasi di destabilizzazione e, quindi, evita le complicazioni che possono essere riscontrate negli approcci di selezione riportati. Nessun requisito per un passaggio vincolante significa anche che questo approccio ha un'utilità generale. Come opzione, può essere inclusa una fase di legame per garantire che le proteine ​​selezionate siano funzionali. Tuttavia, la dipendenza del presente approccio dalla placcatura (per la visualizzazione della placca) introduce una possibile limitazione logistica in termini di numero di lastre che possono essere gestite e quindi limita la sua applicazione a librerie più piccole. Tuttavia, l'utilità dell'approccio attuale può essere estesa a grandi biblioteche, se la libreria viene prima ridotta a una dimensione gestibile. Questo può essere fatto, ad esempio, incorporando nel sistema di selezione un passaggio che eliminerebbe grandi popolazioni di specie instabili, ad esempio l'adsorbimento di librerie su una superficie di proteina A, o su una colonna di interazione idrofobica per rimuovere proteine ​​mal ripiegate con superfici idrofobe esposte (Matsuura, T. et al ., 2003 ). Qui, l'approccio è stato utilizzato per selezionare V H s e V L s di buone proprietà biofisiche in uno sfondo di V H s e V L s molto instabili . Tuttavia, può essere più difficile selezionare la specie "migliore" da una libreria mutante che è popolata con proteine ​​con stabilità ragionevolmente buone. In questo caso, le varianti di piombo possono essere identificate in base alla velocità di formazione della placca utilizzando tempi di incubazione più brevi o in base alla dimensione della placca e ai criteri di frequenza.
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Il presente approccio di selezione può essere esteso all'identificazione di frammenti anticorpali stabili e ben ripiegati come scFvs e Fab con l'inclusione facoltativa, nel sistema di selezione, di una fase di legame che coinvolga la proteina L, A o qualsiasi ligando, nonché -scaffold anticorpali e loro varianti. Inoltre, la correlazione osservata tra la dimensione della placca fagica e la resa dell'espressione V H significa che si può utilizzare il presente approccio per acquisire versioni ad alta espressione di proteine ​​con un'espressione altrimenti scarsa o insoddisfacente da librerie di visualizzazione dei fagi mutanti. Questa applicazione sarebbe particolarmente interessante nel caso di proteine ​​terapeutiche o di costosi reagenti proteici a scarsa espressione, in cui l'aumento dell'espressione proteica compenserebbe significativamente i costi di produzione delle proteine.
Analisi vincolanti dei pentameri
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Sia V L s e V H sono suscettibili di pentamerization s e la pentamerization possono essere utilizzati per convertire rapidamente una bassa affinità V L o V H monomero alta affinità V L o V H pentamero. Tali pentameri sono preziosi agenti diagnostici e di rilevamento. In tali applicazioni, il legame di un V L o V Hil pentamero al suo bersaglio può essere rilevato da una molecola reporter come un enzima (ad esempio, perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina), o una molecola fluorescente coniugata al pentamero. In alternativa, il legame del pentamero può essere rilevato da una molecola secondaria che è coniugata ad una molecola reporter. La molecola secondaria può essere specifica del pentamero stesso o di un suo tag, come un tag 6His o c-Myc. Ad esempio, una tipica molecola secondaria è un'immunoglobulina.
[0049]
Le interazioni tra VHs e proteina A e VLs con la proteina L sono fondamentalmente diverse da quelle tra VHs e VLs con i loro antigeni bersaglio. Il legame con l'antigene di un V H o di un V L coinvolge tre anelli di legame dell'antigene che formano il sito di combinazione di un dominio anticorpale. Il legame alla proteina A di un V H con attività di legame alla proteina A e di un V L con attività di legame alla proteina L coinvolge siti di legame e residui sui domini dell'anticorpo che sono totalmente distinti dal sito di combinazione dell'anticorpo. Quindi, un V Hcon attività di legame alla proteina A può legarsi contemporaneamente alla proteina A e al suo antigene bersaglio e un V L con attività di legame alla proteina L può legarsi contemporaneamente alla proteina L e al suo antigene bersaglio. Poiché gli attuali V H s e V L s hanno affinità per la proteina A e L, rispettivamente, la proteina A e L può essere utilizzata come molecola secondaria per le applicazioni di rilevamento e diagnostiche menzionate sopra. I pentameri umani V H e V L possono essere utilizzati anche per la terapia.