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BREVETTO MILITARE MORGELLONS COME ARMA (INSETTI)
https://patents.google.com/patent/US624553...n?oq=+us6245531
Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor
Polinucleotide che codifica per il recettore dell'ecdisone degli insetti
Le sequenze polinucleotidiche che codificano per i recettori dell'ecdisone sono state isolate ed espresse nelle cellule ospiti.




Ciò che si rivendica è:
1. Un segmento polinucleotidico ricombinante isolato che codifica per un recettore dell'ecdisone di un insetto,
in cui il recettore dell'ecdisone si lega sia a un elemento di risposta all'ecdisone che all'ecdisone; in cui il segmento comprende:
(1) una sequenza nucleotidica codificante per un dominio di legame al DNA a dita di zinco del recettore dell'ormone steroideo che lega un elemento di risposta all'ecdisone, in cui il dominio di legame al DNA comprende una pluralità di residui di cisteina, in cui la sequenza nucleotidica che codifica per il dominio di legame al DNA si ibrida in condizioni di ibridazione selettiva per nucleotidi da 1858 a 2055 del dominio di legame al DNA di Drosophila EcR della Tabella 2; e
(2) una sequenza nucleotidica codificante un dominio di legame dell'ormone che lega l'ecdisone, in cui la sequenza nucleotidica codificante il dominio di legame dell'ormone si ibrida in condizioni di ibridazione selettiva ai nucleotidi da 2359 a 3021 del dominio di legame dell'ecdisone di Drosophila EcR della Tabella 2;
in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono una fase di ibridazione in sale inferiore a 500 mM e almeno 37°C, e lavaggio in 2×SSPE a 63°C.
2. Segmento polinucleotidico ricombinante isolato secondo la rivendicazione 1, in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono meno di 200 mM di sale e almeno 37°C per la fase di ibridazione.
3. Segmento polinucleotidico ricombinante isolato secondo la rivendicazione 1, in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono 2×SSPE e 63°C sia per le fasi di ibridazione che di lavaggio.
4. Un vettore di espressione comprendente il segmento polinucleotidico ricombinante isolato della rivendicazione 1 , in cui il segmento polinucleotidico ricombinante isolato è operativamente collegato ad elementi regolatori della trascrizione.
5. Una cellula ospite isolata trasfettata con il vettore di espressione della rivendicazione 4 .
6. La cellula ospite isolata della rivendicazione 5 che è una cellula vegetale.
7. La cellula ospite isolata della rivendicazione 5 che è un batterio.
8. La cellula ospite isolata della rivendicazione 5 che è una cellula di insetto.
9. La cellula ospite isolata della rivendicazione 5 che è una cellula di mammifero.
10. Metodo per regolare l'espressione di un polipeptide in una cellula ospite che manca di un recettore dell'ecdisone e che è insensibile all'ecdisone, il metodo comprendendo le fasi di:
(I) trasfettare la cellula ospite con un primo e un secondo vettore di espressione in cui:
(A) il primo vettore di espressione è il vettore di espressione della rivendicazione 4 ; e
(B) il secondo vettore di espressione comprende seconde sequenze di regolazione della trascrizione operanti nella cellula ospite trasfettata, in cui le seconde sequenze comprendono l'elemento di risposta dell'ecdisone, in cui le seconde sequenze sono operativamente legate a una sequenza nucleotidica che codifica per il polipeptide per il quale si desidera la regolazione dell'espressione ;
in cui il recettore dell'ecdisone è prodotto nella cellula ospite trasfettata mediante l'espressione del segmento polinucleotidico ricombinante isolato del primo vettore di espressione; e
(II) esponendo la cellula ospite trasfettata all'ecdisone,
dopo di che la cellula ospite trasfettata trascrive la sequenza nucleotidica che codifica per il polipeptide ed esprime il polipeptide, regolando così l'espressione del polipeptide nella cellula ospite trasfettata.
11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono meno di 200 mM di sale e almeno 37°C per la fase di ibridazione.
12. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono 2×SSPE e 63°C sia per le fasi di ibridazione che di lavaggio.
13. Metodo secondo la rivendicazione 10 in cui il segmento polinucleotidico ricombinante codifica per il recettore dell'ecdisone di insetti comprendente la sequenza amminoacidica di Drosophila EcR esposta nella Tabella 2.
14. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui la cellula ospite è un batterio.
15. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui la cellula ospite è una cellula di insetto.
16. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui la cellula ospite è una cellula di mammifero.
17. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui la cellula ospite è una cellula vegetale.
18. Polinucleotide ricombinante comprendente un segmento di acido nucleico codificante una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende:
(1) una prima sequenza nucleotidica codificante un dominio di legame al DNA; e
(2) una seconda sequenza nucleotidica codificante un dominio di legame dell'ormone che lega l'ecdisone, in cui la seconda sequenza nucleotidica si ibrida in condizioni di ibridazione selettiva ai nucleotidi 2359-3021 del dominio di legame dell'ecdisone di Drosophila EcR della Tabella 2;
in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono una fase di ibridazione in sale inferiore a 500 mM e almeno 37° C., e una fase di lavaggio in 2×SSPE a 63° C., e in cui il dominio di legame al DNA e il dominio di legame all'ormone provengono da diversi membri della superfamiglia dei recettori degli steroidi.
19. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 18 in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono meno di 200 mM di sale e almeno 37°C per la fase di ibridazione.
20. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 18, in cui le condizioni di ibridazione selettiva comprendono 2×SSPE e 63°C sia per le fasi di ibridazione che di lavaggio.
21. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 18 in cui il dominio di legame ormonale codificato dalla seconda sequenza nucleotidica comprende amminoacidi 431-651 della Tabella 2.
22. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 18 in cui la seconda sequenza nucleotidica comprende i nucleotidi 2359-3021 della Tabella 2.
23. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 18, in cui il dominio di legame al DNA è il dominio di legame al DNA di un recettore dell'ecdisone di un insetto.
24. Un vettore di espressione comprendente il polinucleotide ricombinante della rivendicazione 18 operativamente legato ad elementi regolatori della trascrizione.
25. Una cellula ospite trasfettata con il vettore di espressione della rivendicazione 24 .
26. La cellula ospite della rivendicazione 25 che è una cellula vegetale.
27. La cellula ospite della rivendicazione 25 che è un batterio.
28. La cellula ospite della rivendicazione 25 che è una cellula di insetto.
29. La cellula ospite della rivendicazione 25 che è una cellula di mammifero.
30. Metodo per regolare l'espressione di un polipeptide in una cellula ospite che manca di un recettore dell'ecdisone e che è insensibile all'ecdisone, il metodo comprendendo le fasi di:
(I) trasfettare la cellula ospite con un primo e un secondo vettore di espressione in cui:
(A) il primo vettore di espressione è il vettore di espressione della rivendicazione 24 ;
(B) il secondo vettore di espressione comprende seconde sequenze regolatorie di trascrizione operanti nella cellula ospite trasfettata, in cui le seconde sequenze comprendono l'elemento di risposta dell'ecdisone che lega il dominio di legame al DNA della proteina di fusione codificata dal primo vettore di espressione, in cui le seconde sequenze sono legato operativamente ad una sequenza nucleotidica codificante per il polipeptide per il quale si desidera la regolazione dell'espressione;
in cui la proteina di fusione è prodotta nella cellula ospite trasfettata mediante espressione del segmento polinucleotidico ricombinante isolato del primo vettore di espressione; e
(II) esponendo la cellula ospite trasfettata all'ecdisone,
dopo di che la cellula ospite trasfettata trascrive la sequenza nucleotidica che codifica per il polipeptide ed esprime il polipeptide, regolando così l'espressione del polipeptide nella cellula ospite trasfettata.
31. Metodo secondo la rivendicazione 30, in cui la cellula ospite è un batterio.
32. Metodo secondo la rivendicazione 30, in cui la cellula ospite è una cellula di insetto.
33. Metodo secondo la rivendicazione 30, in cui la cellula ospite è una cellula di mammifero.
34. Metodo secondo la rivendicazione 30, in cui la cellula ospite è una cellula vegetale.
35. Un segmento polinucleotidico ricombinante isolato che codifica un dominio di legame dell'ormone di un recettore steroideo di un insetto, in cui il dominio di legame dell'ormone si lega all'ecdisone, in cui il segmento polinucleotidico che codifica per il dominio di legame dell'ormone si ibrida ai nucleotidi da 2359 a 3021 del dominio di legame dell'ecdisone di Drosophila EcR della Tabella 2 in condizioni di ibridazione comprendente una fase di ibridazione in sale inferiore a 500 mM e almeno 37°C, e una fase di lavaggio in 2×SSPE a 63°C.
36. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 35 in cui le condizioni di ibridazione comprendono meno di 200 mM di sale e almeno 37°C per la fase di ibridazione.
37. Polinucleotide ricombinante secondo la rivendicazione 35 in cui le condizioni di ibridazione comprendono 2×SSPE e 63°C sia per l'ibridazione che per la fase di lavaggio.
38. Un vettore di espressione comprendente il polinucleotide ricombinante della rivendicazione 35 collegato operativamente ad elementi regolatori della trascrizione.
39. Cellula ospite comprendente il vettore di espressione della rivendicazione 35 , in cui gli elementi di regolazione della trascrizione sono operativi nella cellula.
40. Cellula ospite secondo la rivendicazione 39 che è una cellula vegetale.
41. La cellula ospite della rivendicazione 39 che è un batterio.
42. La cellula ospite della rivendicazione 39 che è una cellula di insetto.
43. La cellula ospite della rivendicazione 39 che è una cellula di mammifero.
44. Un segmento polinucleotidico ricombinante isolato che codifica un dominio di legame dell'ormone di un recettore dell'ecdisone di un insetto, in cui il dominio di legame dell'ormone mostra un legame saturabile con l'ecdisone di un ecdisteroide, in cui il segmento del polinucleotide che codifica il dominio di legame dell'ormone ibidizza ai nucleotidi da 2359 a 3021 del dominio di legame dell'ecdisone di Drosophila EcR della Tabella 2 in condizioni di ibridazione comprendente una fase di ibridazione in sale inferiore a 500 mM e almeno 37°C, e una fase di lavaggio in 2×SSPE a 63°C.
45. Polinucleotide secondo la rivendicazione 44 , in cui l'ecdisteroide è ponastrone A.

Gli ormoni che complessi con mammiferi o altri membri vertebrati della superfamiglia dei recettori degli steroidi sono candidati improbabili per tali fattori innocui, né si è scoperto che soddisfano le proprietà richieste di tali fattori, perché le cellule di mammifero contengono questi recettori, o proteine ​​altamente omologhe, che altererebbe l'espressione di molti geni bersaglio in presenza del rispettivo ormone, influenzando così negativamente le cellule ospiti.

Pertanto, esiste la necessità di informazioni dettagliate sulla sequenza dei membri degli insetti della superfamiglia dei recettori degli steroidi e dei geni che codificano questi recettori e dei reagenti risultanti utili nella ricerca di nuove molecole che possono agire come agonisti o antagonisti dei membri naturali degli insetti del recettore degli steroidi. superfamiglia, o come componenti di sistemi per la regolazione altamente specifica di proteine ​​ricombinanti nelle cellule di mammifero.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE
In accordo con la presente invenzione, vengono forniti acidi nucleici ricombinanti isolati che, dopo l'espressione, sono in grado di codificare per un recettore steroideo vertebrato diverso da quello nativo o un suo frammento. Questi acidi nucleici comprendono tipicamente un segmento avente una sequenza sostanzialmente omologa a una o più regioni codificanti dei domini A, B, D, E o F da un gene membro della superfamiglia del recettore degli steroidi di insetti avente omologia di dominio di legame con gli steroidi. Preferibilmente, gli acidi nucleici codificano per un polipeptide in grado di legarsi a un ligando per un membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti e sono in grado di ibridarsi con un segmento genico del membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti in condizioni di ibridazione selettiva, generalmente condizioni di ibridazione rigorose. Sono fornite anche cellule di mammifero trasformate con gli acidi nucleici.

La presente invenzione prevede anche nuove ed utili combinazioni dei vari componenti correlati. Le sequenze di acido nucleico ricombinante che codificano per i polipeptidi, le sequenze polipeptidiche e i siti di DNA a cui si legano i recettori (cioè gli elementi regolatori o di controllo) insieme forniscono la combinazione di particolari componenti in modi nuovi. Ad esempio, dopo l'espressione, la fusione di sequenze di acidi nucleici codificanti peptidi provenienti da fonti diverse fornirà polipeptidi che presentano proprietà ibride. In particolare, verranno realizzati recettori ibridi comprendenti segmenti provenienti da altri membri della superfamiglia, o da altre fonti. I costrutti genetici ibridi forniscono geni che presentano caratteristiche di controllo ed espressione insolite.
L'isolamento dei recettori degli steroidi degli insetti prevede l'isolamento o lo screening di nuovi ligandi per il legame del recettore. Alcuni di questi interferiranno o interromperanno il normale sviluppo degli insetti. A volte può essere importante accelerare o rallentare lo sviluppo degli insetti, ad esempio, nella preparazione di adulti sterili per il rilascio. In alternativa, in determinate circostanze, un ritardo o un cambiamento nei tempi di sviluppo può essere letale o può modificare drasticamente la capacità di un insetto di influenzare una coltura agricola. Pertanto, ne risulteranno molecole naturali, biodegradabili e altamente attive per interrompere i tempi dello sviluppo degli insetti.
Inoltre, questi polipeptidi forniscono i mezzi con cui sono stati generati gli anticorpi. Questi anticorpi possiedono specificità per il legame a particolari classi di recettori steroidei. Pertanto, possono essere prodotti reagenti per determinare la presenza qualitativa o quantitativa di questi o di polipeptidi omologhi. In alternativa, questi anticorpi possono essere usati per separare o purificare i polipeptidi recettoriali.
Sequenze di trascrizione dei membri della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti
Il gene del recettore dell'ecdisone è un membro della superfamiglia del gene del recettore degli steroidi e degli ormoni tiroidei. I recettori degli steroidi e i recettori degli ormoni tiroidei sono componenti di un gruppo collettivo di fattori di trascrizione sensibili al ligando. Vedi, Evans, Science 240: 889-895 (1988), e Segraves, molecolare e analisi genetica della E 75 Ecdysone - Gene Responsive di Drosophila melanogaster(tesi di dottorato, Stanford University 1988), entrambi i quali sono qui incorporati come riferimento per tutti gli scopi. Questi recettori mostrano un'ampia somiglianza di sequenza, specialmente nei loro domini di legame al DNA "a dito di zinco", e anche in un ligando, o ormone, dominio di legame. La modulazione dell'espressione genica avviene apparentemente in risposta al legame del recettore a specifici elementi di controllo, o regolatori, nel DNA. Il clonaggio dei cDNA del recettore offre la prima opportunità di studiare le basi molecolari dell'azione degli steroidi. La superfamiglia dei recettori steroidei è una classe di recettori che presentano somiglianze nelle caratteristiche strutturali e funzionali. Sebbene il termine insetto sia qui usato, si riconoscerà che gli stessi metodi e molecole possono essere derivati ​​da altre specie di animali, in particolare, all'interno della classe Insecta, ma più in generale dovrebbe essere applicabile a tutti i membri del phylum Arthropoda, che usano gli ecdisteroidi come ormoni. Pertanto, sebbene il termine insetto sia qui usato, si riconoscerà che in alcune circostanze può essere incluso anche il gruppo più ampio di artropodi. I membri della superfamiglia dei recettori degli steroidi degli insetti (superfamiglia) sono caratterizzati da domini funzionali coinvolti nel legame del ligando e del DNA, entrambi i quali interagiscono per effettuare un cambiamento nello stato regolatorio di un gene operabilmente legato al sito di legame del DNA del recettore . Pertanto, i recettori della superfamiglia dei recettori degli steroidi degli insetti sembrano essere fattori di trascrizione sensibili al ligando. I recettori della presente invenzione presentano almeno un dominio di legame ormonale caratterizzato da omologia di sequenza a particolari regioni, marcate E1, E2 ed E3.


frammenti di DNA naturali o sintetici che codificano per un frammento del recettore steroideo desiderato saranno incorporati in costrutti di DNA in grado di essere introdotti ed espressi in una coltura cellulare in vitro. Solitamente i costrutti di DNA saranno adatti per la replicazione in un ospite unicellulare, come lievito o batteri, ma possono anche essere destinati all'introduzione, con e senza e all'integrazione all'interno del genoma, in colture di mammiferi o piante o altre linee cellulari eucariotiche. I costrutti di DNA preparati per l'introduzione in batteri o lieviti includeranno tipicamente un sistema di replicazione riconosciuto dall'ospite, il frammento di DNA previsto che codifica il polipeptide recettore desiderato, sequenze regolatorie di iniziazione trascrizionale e traslazionale collegate operativamente al segmento codificante polipeptidico e sequenze regolatorie di terminazione trascrizionale e traduzionale collegate operativamente al segmento codificante polipeptidico. Le sequenze regolatorie trascrizionali includeranno tipicamente un potenziatore o promotore eterologo riconosciuto dall'ospite. La selezione di un promotore appropriato dipenderà dall'ospite, ma sono noti promotori come i promotori trp, lac e fagici, promotori di tRNA e promotori di enzimi glicolitici. Vedi, Sambrook et al. (1989). Possono essere impiegati vettori di espressione convenientemente disponibili che includono il sistema di replicazione e sequenze regolatorie trascrizionali e traduzionali insieme al sito di inserimento per la sequenza di DNA del recettore steroideo. Esempi di combinazioni praticabili di linee cellulari e vettori di espressione sono descritti in Sambrook et al. (1989); si veda anche Metzger et al. (1988),Natura 334:31-36.
Costrutti genetici
I segmenti di DNA che codificano per i membri della superfamiglia dei recettori degli steroidi degli insetti saranno tipicamente utilizzati in un vettore plasmidico. Esistono due forme di realizzazione separate, la prima avente una sequenza di DNA di controllo dell'espressione operativamente collegata al membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti sequenze codificanti per l'espressione del solo membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti. Un secondo include un membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti come componente di un sistema di espressione per un altro gene per rendere sensibile l'espressione di quell'altro ligando genico. Quest'ultima forma di realizzazione è descritta separatamente appena sotto. Le sequenze di controllo dell'espressione saranno comunemente sistemi promotori o stimolatori eucariotici in vettori in grado di trasformare o trasfettare cellule ospiti eucariotiche. Una volta che il vettore è stato incorporato nell'ospite appropriato, l'ospite,
Espressione responsiva agli steroidi di geni selezionati
Per l'espressione di altri geni responsivi agli steroidi, il gene del recettore degli steroidi sarà tipicamente cotrasformato con un costrutto ricombinante comprendente un gene desiderato per l'espressione collegato operativamente all'elemento promotore o promotore responsivo agli steroidi. In questo uso, un singolo sistema di espressione comprenderà tipicamente una combinazione di (1) un elemento di controllo sensibile a un ligando di un membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti, (2) un gene desiderato per l'espressione, collegato operativamente all'elemento di controllo, e ( 3) un membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti che può legarsi all'elemento di controllo. Di solito, questo sistema sarà all'interno di una cellula, ma è anche possibile un sistema in vitro. Il membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti sarà tipicamente fornito dall'espressione di un acido nucleico che lo codifica, sebbene non debba essere espresso a livelli particolarmente elevati. Pertanto, in una forma di realizzazione preferita, il sistema sarà ottenuto attraverso la cotrasformazione di una cellula sia con il costrutto regolabile che con un altro segmento che codifica il membro della superfamiglia del recettore degli steroidi degli insetti. Di solito, l'elemento di controllo sarà un elemento di potenziamento, ma potrebbe funzionare al contrario ed essere utilizzato per reprimere l'espressione. In questa forma di realizzazione, il ligando per il membro della superfamiglia del recettore degli steroidi insetti sarà fornito o trattenuto come appropriato per le proprietà di espressione desiderate. ma può funzionare al contrario ed essere usato per reprimere l'espressione. In questa forma di realizzazione, il ligando per il membro della superfamiglia del recettore degli steroidi insetti sarà fornito o trattenuto come appropriato per le proprietà di espressione desiderate. ma può funzionare al contrario ed essere usato per reprimere l'espressione. In questa forma di realizzazione, il ligando per il membro della superfamiglia del recettore degli steroidi insetti sarà fornito o trattenuto come appropriato per le proprietà di espressione desiderate.

Tradotto dall'inglese-La mutagenesi è un processo mediante il quale l'informazione genetica di un organismo viene modificata dalla produzione di una mutazione. Può verificarsi spontaneamente in natura o come risultato dell'esposizione a mutageni. Può anche essere ottenuto sperimentalmente utilizzando procedure di laboratorio.